论文部分内容阅读
研究背景:血管新生在疾病的发病机制中有极其重要的作用,如果发生异常,机体会出现疾病,如肿瘤、脑中风、冠心病、多种眼科疾病等。VEGF/VEGFR2信号通路在血管新生过程中参与新血管的生长与重建,血管生成因子通过调控血管内皮细胞表面的VEGFR2的活化及表达,进而激活或抑制其下游相关信号传导通路的信号传导,从而发挥调控血管内皮生长增殖与机体血管形成的作用。本课题组在前期研究发现洛克沙胂(ROX)在体内外能促进血管生成,使VEGF/VEGFR2的表达上调。本文利用VEGFR2的有效沉默基因序列,构建靶向vegfr2基因的siRNA重组慢病毒的载体系统。使用重组慢病毒感染内皮细胞,沉默VEGFR2的表达,以此阻断VEGF/VEGFR2信号通路的传导,研究VEGFR2在ROX促血管生成作用中的调节作用。研究目的:通过构建慢病毒载体表达靶向vegfr2基因的shRNA,沉默VEGF/VEGFR2信号通路中的关键受体VEGFR2,研究ROX促进内皮细胞生长、体外血管生成作用中的VEGF/VEGFR2作用机制。方法:①重组慢病毒载体的构建:分别构建靶向大鼠vegfr2基因的shRNA慢病毒表达载体和阴性RNA对照的慢病毒载体。筛选出感染大鼠内皮细胞的条件,通过RT-PCR和Western-Blot检测VEGF的表达,评价所建慢病毒载体对靶基因的干扰效率。②靶向vegfr2慢病毒载体干扰对ROX促进大鼠血管内皮细胞生长的影响:不同处理分组如下:PBS 组、1.0 μM 的 ROX 组、NC 组(阴性 shRNA 组)、sh-vegfr2 组、sh-vegfr2+ROX组。通过内皮细胞BrdU阳性率、迁移距离、管样结构的节点数和分支长度,分别检测血管内皮细胞的增殖、迁移距离和管样结构的形成能力;Western-Blot检测感染内皮细胞中VEGFR2的蛋白表达水平。结果:①所构建的重组慢病毒载体能够表达靶向vegfr2的shRNA预期序列,病毒滴度可达1×109 TU/ml。重组慢病毒感染内皮细胞的优化条件为病毒感染量为40 MOI及0.5 μg/ml Polybrene,感染效率可达到90%以上。RT-PCR和Western blot的结果显示重组慢病毒对内皮细胞VEGFR2的沉默效应达70%以上。②靶向vegfr2慢病毒载体与ROX联合处理内皮细胞试验中,ROX单独处理组细胞增殖、迁移及管样结构的生长极显著高于对照组(P<0.01)。sh-vegfr2组内皮细胞的BrdU阳性率、迁移距离、管样结构的节点数和分支长度都极显著低于对照组(P<0.01);内皮细胞中VEGF和VEGFR2蛋白的表达显著少于对照组(P<0.01)。sh-vegfr2+ROX组的内皮细胞增殖、迁移和管形成能力及相应蛋白的表达都显著低于ROX单独处理组(P<0.01)。结论:①成功构建了较高滴度的靶向大鼠.vegfr2基因的慢病毒载体,对内皮细胞VEGFR2的沉默效应达70%以上。②靶向vegfr2慢病毒载体能有效抑制由洛克沙胂引起的内皮细胞增殖、迁移及管样结构形成的促进作用,说明VEGFR2机制在洛克沙胂体外促血管生成作用中发挥着重要的调节作用。