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[目的]探究牙龈间充质干细胞(human gingiva-derived mesenchymal stem cells,hGMSCs)成骨分化过程中内源性硫化氢含量的改变;探究外源性硫化氢及TGF-β信号通路小分子抑制剂SB431542对hGMSCs成骨分化的作用;探究在hGMSCs成骨分化过程中硫化氢和TGF-β信号通路之间的关系。[方法]经患者签署知情同意书,获取牙龈组织临床样本,组织块法分离培养原代细胞,通过流式细胞术检测细胞表面标记物,茜素红染色鉴定细胞体外成骨能力及1μM SB431542对hGMSCs成骨分化的作用;激光共聚焦实验检测新型硫化氢荧光探针CouMC与hGMSCs细胞内硫化氢的结合能力,为探究成骨分化过程中内源性硫化氢含量的改变,使用流式细胞术分别检测hGMSCs于成骨培养基和含1μM SB431542成骨培养基诱导7天后内源性硫化氢含量;为进一步探究外源性硫化氢及TGF-β信号通路对hGMSCs成骨分化的作用及硫化氢与TGF-β信号通路之间的关系,将hGMSCs分为六组:对照组:间充质干细胞培养基;成骨组:间充质干细胞成骨诱导培养基;SB431542组:含1μM SB431542的间充质干细胞成骨诱导培养基;H2S+对照组:含100μM H2S的间充质干细胞培养基;H2S+成骨组:含100μM H2S的间充质干细胞成骨诱导培养基;H2S+SB431542组:含100μM H2S和1μM SB431542的间充质干细胞成骨诱导培养基。成骨培养21天后,茜素红染色检测hGMSCs各组细胞体外成骨能力,并于成骨诱导7天进行Western Blotting及RT-qPCR从蛋白和基因水平上分别检测成骨重要转录因子Runx-2、硫化氢内源性生成酶CBS、CSE及TGF-β信号通路下游分子Smad2、Smad3的表达量。[结果]原代细胞均贴壁、克隆性生长,呈短梭状;hGMSCs干细胞表面标记物CD73(99.94%)、CD90(99.91%)高表达,造血干细胞表面标记物CD34(0.26%)、CD45(0.21%)低表达,符合间充质干细胞的鉴定标准。成骨诱导21天茜素红染色结果显示:对照组未见明显的矿化结节,成骨组可见均匀分布的红色钙化结节,SB431542组可见大面积的矿化结节。硫化氢荧光探针CouMC结合流式细胞术检测hGMSCs成骨过程中内源性硫化氢含量,结果显示:SB431542组的内源性硫化氢含量大于成骨组,结果具有统计学意义。为探究外源性硫化氢及TGF-β信号通路对hGMSCs成骨分化的作用及硫化氢与TGF-β信号通路之间的关系,在hGMSCs成骨诱导过程中外源性加入100μM H2S和1μM SB431542。成骨诱导21天茜素红染色显示:H2S+成骨组、SB431542组与成骨组相比,矿化结节的数量和大小明显增多,但两者之间并没有明显差异,所有组中,H2S+SB431542组的矿化面积最大,矿化结节的大小也明显大于其他组。Western Blotting结果显示:SB431542组的Runx-2蛋白表达量大于成骨组,H2S+成骨组的Runx-2蛋白表达量大于成骨组,且H2S+SB431542组的Runx-2蛋白表达量大于SB431542组和H2S+成骨组,与茜素红染色结果一致。SB431542处理后CBS、CSE蛋白表达量均升高,Smad2、Smad3表达量均增加;加入外源性硫化氢后CBS、CSE、Smad2、Smad3 蛋白表达均降低。RT-qPCR 检测 CBS、CSE、Smad2、Smad3表达与蛋白水平相似。SB431542促进成骨组、H2S+成骨组CBS、CSE、Smad2、Smad3基因表达,但是外源性硫化氢抑制CBS、CSE、Smad2、Smad3基因表达。以上结果均具有统计学意义。[结论]外源性硫化氢和TGF-β信号通路小分子抑制剂SB431542均可促进hGMSCs成骨转录因子Runx-2的蛋白表达,提高体外成骨能力,且在hGMSCs中表现为协同作用;外源性硫化氢可反馈性的抑制抑制CBS、CSE生成,提高hGMSCs成骨能力;SB431542可促进hGMSCs成骨过程中CBS、CSE的表达,提高hGMSCs内源性硫化氢含量;外源性硫化氢降低hGMSCs的TGF-β信号通路下游分子Smad2、Smad3表达,SB431542提高Smad2、Smad3表达,提示硫化氢可能通过其它途径促进成骨,硫化氢与TGF-β信号通路之间的关系还需进一步探索。