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[背景]病理性心肌肥厚（Pathological Cardiac Hypertrophy）是继发于高血压,心肌梗死,机械压力超负荷,心律失常,神经内分泌激素过度激活导致的心脏病理改变,是引起心力衰竭和心源性猝死的独立危险因素。缩宫素（oxytocin,OT）是一种心血管稳态激素,具有减轻心肌缺血/再灌注损伤,抗动脉粥样硬化和延缓糖尿病心肌病发生发展等心脏保护作用。研究发现,缩宫素发挥抗心肌缺血梗死保护效应时,还具有减轻心肌肥厚、纤维化的作用,而有关缩宫素对病理性心肌肥厚的作用及机制的研究较少,目前,缩宫素对心肌肥厚的保护作用及分子机制仍没有明确。非编码RNA在真核生物基因组中所占比例高达98%,包括长链非编码RNA（Longnon-coding RNA,lncRNA）,微小 RNA（microRNA,miRNA）和环状 RNA（circular RNA,circRNA）等,它们在心肌肥厚的发生发展中发挥重要的调控作用。LncRNA-miRNA-mRNA可形成调控网络,通过竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）机制控制细胞内肥厚信号的传递。我们课题组前期研究发现,缩宫素发挥抗心肌缺血/再灌注损伤保护效应时,显著降低心肌细胞内miR-375-3p的表达。多个研究证实,靶向抑制miR-375-3p的表达可减轻心肌肥厚的发展。同时,通过生物信息学预测分析,我们寻找到能与miR-375-3p互补结合的上游基因——长链非编码RNA-生长停滞特异性转录本5（Long non-coding RNA growth arrest specific transcript 5,lncRNA GAS5）,以及 miR-375-3p 的下游靶基因——Kruppel样因子4（Kruppel like factor 4,KLF4）。因此,我们提出假说,缩宫素发挥抗心肌肥厚效应机制可能与上调lncRNA GAS5,减少miR-375-3p表达,进而促进KLF4蛋白表达有关,本研究尝试从LncRNAGAS5/miR-375-3p/KLF4调控网络以及磷脂酰肌醇3/蛋白激酶B（Phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/AKT）信号通路为切入点,通过细胞生物学、分子生物学和在体动物实验,探讨缩宫素抗心肌肥厚的分子机制。[方法]第一部分:缩宫素改善异丙肾上腺素（isoproterenol,ISO）诱导的大鼠心肌肥厚和纤维化的效应研究:选用雄性SD大鼠,颈背部皮下注射异丙肾上腺素（ISO,1.5mg/kg/day）14天诱导病理性心肌肥厚;缩宫素（OT,0.03 μg/kg或3μg/kg）预处理或后处理14天。大鼠随机分为6组:对照组（Control,n=6）,异丙肾上腺素组（ISO组,n=8）,低剂量缩宫素后处理组[ISO+OT（0.03μg/kg）post,n=8],高剂量缩宫素后处理组[ISO+OT（3 μg/kg）post,n=8],缩宫素预处理组[ISO+OT（3 μg/kg）pre,n=8],和缩宫素组[OT（3 μg/kg）,n=6];给药周期结束后,通过心脏彩超评估大鼠心脏结构和功能,称取记录大鼠体重,取下心脏称取记录心脏质量,计算心重比（HW/BW）;苏木素-伊红（H＆E）染色、麦胚凝集素（WGA）染色和Masson染色观察心脏组织病理学改变;实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法检测心肌肥厚和纤维化标志物（BNP,β-MHC和α-SMA）mRNA表达水平以及lncRNAGAS5表达水平。第二部分:缩宫素抑制异丙肾上腺素诱导的心肌细胞肥大的机制研究:用ISO（10 μM）体外刺激大鼠原代培养心肌细胞,建立离体心肌细胞肥大模型;治疗组用缩宫素（10nM）与ISO（10μM）共孵育24h;H＆E染色观察心肌细胞形态变化;qRT-PCR 检测 lncRNA GAS5,miR-375-3p,KLF4 mRNA 表达水平;Western blot 检测 BNP、β-MHC、KLF4、PI3K、p-PI3K、AKT1、p-AKT1 蛋白表达水平。第三部分:缩宫素通过lncRNA GAS5/miR-375-3p/KLF4轴调控PI3K/AKT信号通路发挥抗心肌肥厚的机制研究:双荧光素酶报告基因实验分别验证lncRNAGAS5 和 miR-375-3p 与 miR-375-3p 和 KLF4 mRNA 之间的靶向结合关系;心肌细胞转染shRNA-GAS5构建lncRNAGAS5低表达细胞,共转染shRNA-GAS5 和 miR-375-3pinhibitor 设计挽救实验,ISO（10μM）和 OT（10nM）共处理 24h,实验细胞分为四组:①ISO+OT+shRNA-scramble 组;②ISO+OT+shRNA-GAS5 组;③ISO+OT+shRNA-GAS5+miR-375-3p inhibitor NC 组;④ISO+OT+shRNA-GAS5+miR-375-3p inhibitor 组。心肌细胞转染 miR-375-3p mimics 以过表达 miR-375-3p,共转染 miR-375-3p mimics 和 KLF4 pcDNA 设计挽救实验,ISO（10 μM）和OT（10 nM）共处理24h,实验细胞分为四组:①ISO+OT+miR-375-3p mimics NC 组;②ISO+OT+miR-375-3p mimics 组;③ISO+OT+miR-375-3p mimics+pcDNA-NC 组;④ISO+OT+miR-375-3p mimics+pcDNA-KLF4组。心肌细胞转染shRNA-KLF4构建KLF4低表达细胞,增加PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002处理设计挽救实验,ISO（10 μM）和OT（10 nM）共处理24h。实验细胞分为三组:①ISO+OT+shRNA-NC;②ISO+OT+shRNA-KLF4;③ISO+OT+shRNA-KLF4+LY294002。心肌细胞免疫荧光染色观察细胞形态学变化,qRT-PCR检测lncRNA GAS5、miR-375-3p、KLF4 mRNA确认转染效率;Western blot检测BNP、β-MHC蛋白,评估缩宫素抗心肌肥厚效应改变;检测KLF4、PI3K、p-PI3K、AKT1、p-AKT1蛋白表达水平,评估miR-375-3p与KLF4以及miR-375-3p与PI3K/AKT信号通路之间的调控关系。[结果]第一部分:1、心脏超声评估结果提示,ISO处理14天显著增加大鼠左室舒张期和收缩期后壁厚度（LVPWd和LVPWs）,缩宫素（3 μg/kg）后处理显著减小LVPWd和LVPWs（p＜0.05或p＜0.01）;2、心脏组织WGA染色结果显示,与ISO组比较,缩宫素（3 μg/kg）后处理可以明显减小心肌细胞截面积（p＜0.01）;Masson染色结果显示,缩宫素（3 μg/kg）后处理组与ISO组比较,胶原容积分数明显减小（p＜0.05）,心肌纤维化程度明显减轻。3、qRT-PCR结果显示,ISO处理显著增加了心肌肥厚标志物基因（BNP和β-MHC）和纤维化标志物基因（α-SMA）的表达（p＜0.05或p＜0.01）,缩宫素（3 μg/kg）后处理显著降低了 BNP,β-MHC和α-SMA mRNA的表达（p＜0.05或p＜0.01）;与ISO组比较,缩宫素（3μg/kg）后处理组明显增加了 lncRNAGAS5的表达（p＜0.01）。第二部分:1、心肌细胞H＆E染色结果提示,ISO刺激使心肌细胞体积明显增大（p＜0.01）,OT处理减小了 ISO导致的心肌细胞体积增大（p＜0.01）。2、与对照组相比,ISO（10μM）明显增加BNP,β-MHC蛋白表达水平（p＜0.01）,OT（10nM）共处理显著降低ISO导致的BNP和β-MHC表达水平的升高（p＜0.01）。3、与对照组相比,ISO组lncRNAGAS5、KLF4mRNA和蛋白表达显著下调（p＜0.05 或p＜0.01）,OT 处理后可使 lncRNAGAS5、KLF4mRNA 和蛋白表达显著增加（p＜0.05或p＜0.01）;相反,miR-375-3p在ISO组表达显著上调（p＜0.01）,OT处理后可使miR-375-3p表达显著下调（p＜0.01）。4、与对照组相比,ISO刺激后心肌细胞内p-PI3K/PI3K和p-AKT1/AKT1比值显著增加（p＜0.01）,OT 处理后明显降低 p-PI3K/PI3K 和 p-AKT1/AKT1 比值（p＜0.05 或p＜0.01）。第三部分:1、双荧光素酶报告基因实验证实lncRNA GAS5和miR-375-3p之间存在靶向结合关系;KLF4是miR-375-3p的直接靶基因;2、lncRNA GAS5的敲减增加了细胞内miR-375-3p的富集,减少了 KLF4 mRNA和蛋白的表达,同时表现出OT的抗心肌细胞肥大作用被削弱,共转染shRNA-GAS5和miR-375-3p inhibitor,OT的抗肥厚效应得到回复;3、miR-375-3p的过表达减低了 KLF4 mRNA和蛋白的表达水平,激活PI3K/AKT信号通路,同时表现出OT的抗心肌细胞肥大作用被减弱,共转染miR-375-3p mimics和KLF4 pcDNA时,OT的抗肥厚效应得到部分回复;4、KLF4的敲减增加了细胞内PI3K/AKT信号通路的激活,OT的抗心肌细胞肥大作用被抑制,LY294002处理抑制PI3K/AKT信号通路后,OT的抗心肌肥厚效应得到回复。[结论]1、缩宫素可以明显减轻ISO诱导的心肌肥厚;2、lncRNAGAS5/miR-375-3p/KLF4轴介导了缩宫素的抗心肌肥厚效应;3、PI3K/AKT信号通路是lncRNA GAS5/miR-375-3p/KLF4轴下游的信号通路,且参与缩宫素的抗心肌肥厚效应。