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研究背景
强直性脊柱炎是一种慢性自身免疫性疾病，在轴向骨骼中有严重的炎症症状，导致机体结构和功能性损伤。在我国强直性脊柱炎的患病率约为0.1-0.3%，其中男性多于女性，病因尚不清楚。强直性脊柱炎主要的治疗手段为物理治疗、药物治疗、生物制剂治疗及外科治疗，目前尚无有效的延缓疾病进程或改变强直性脊柱炎患者病变局部炎症的药物。强直性脊柱炎作为一种慢性、进展性的炎性疾病，诊断和治疗方面面临许多困难。因此，强直性脊柱炎特异性靶点的筛选及靶点相关疾病分型，对于疾病的诊断和治疗具有重要意义。
TNFAIP3，也称为A20，是调节免疫反应的重要分子，其表达缺乏与自身免疫疾病高度相关。小鼠模型中不同免疫细胞缺乏TNFAIP3分子，可出现多种自身免疫疾病，如系统性红斑狼疮，多关节炎和肠炎等。这表明TNFAIP3是自身免疫病的关键分子。TNFAIP3分子可通过调节靶分子泛素化修饰，抑制NFκB通路活性，进而抑制机体免疫功能。TNFAIP3分子上游受NFκB通路调控。当细胞受到TNF、LPS或IL1B等刺激时，NFκB通路活化，上调TNFAIP3分子表达。因此TNFAIP3是免疫反应中重要的负反馈调节因子。
目前，强直性脊柱炎的病因不明，TNFAIP3分子在人强直性脊柱炎中的作用及机制未有报道；同时，已知TNFAIP3的分子功能多集中于泛素化修饰其靶分子进而抑制NFκB通路上游活化信号传递，是否存在NFκB通路下游致炎因子分泌相关的负向调控机制目前尚未有充分认识。因此，本课题从TNFAIP3分子出发，结合强直性脊柱炎外周血表达差异分析及TNFAIP3分子相互作用复合物筛查，研究TNFAIP3分子多重负向调控炎症信号作用机制，探索TNFAIP3在强直性脊柱炎疾病发生发展中的作用及意义。
研究目标
课题研究目标主要分为五个方面：
1)分析TNFAIP3分子在强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞表达差异。
2)研究TNFAIP3分子在强直性脊柱炎差异表达细胞亚群中的免疫学功能。
3)筛选TNFAIP3分子潜在互作分子。
4)探索TNFAIP3及其相互作用分子功能及机制。
5)验证TNFAIP3及其相互作用分子在强直性脊柱炎中的功能。
研究方法
第一部分，收集强直性脊柱炎患者和健康对照外周血单个核细胞，进行表面分子标记及TNFAIP3荧光染色，利用多色流式分析，研究TNFAIP3分子在不同免疫细胞中表达差异。先将免疫细胞分为淋巴细胞、单核细胞及粒细胞三大类。针对炎性疾病高度相关的Th17、Treg细胞等进一步分群，研究TNFAIP3在AS及HC表达差异。同时，将外周血单核细胞进一步分为CD14++CD16-经典型单核细胞、CD14+CD16++的非经典型单核细胞及中间型单核细胞。根据不同免疫细胞亚群中TNFAIP3在患者及健康人群的表达差异，预测TNFAIP3在其中可能存在的功能及机制。
第二部分，根据第一部分免疫细胞亚群筛选结果，建立体外机制研究模型。通过TNFAIP3shRNA慢病毒干涉、siRNA干涉等方法，降低细胞中TNFAIP3分子表达。进一步通过ELISA、实时定量PCR、蛋白质印迹、免疫荧光、透射电子显微镜等检测方法，研究细胞中缺乏TNFAIP3分子对炎症相关信号的影响及作用机制。
第三部分，建立酵母双杂交文库筛选平台，利用带有TNFAIP3cDNA诱饵质粒酵母与人胚cDNA文库酵母进行杂交，筛选TNFAIP3潜在的相互作用分子。对筛选出的TNFAIP3相互作用分子进行分析，寻找具有免疫学功能的相互作用复合物。
第四部分，验证TNFAIP3复合物并探究其功能。通过共聚焦显微镜和共免疫沉淀及GSTpulldown等实验确定TNFAIP3相互作用复合物。对TNFAIP3复合物功能的研究，主要通过蛋白质印迹、免疫荧光和透射电子显微镜检测自噬和炎症小体活化水平。为进一步研究TNFAIP3的分子机制，建立了不同的TNFAIP3截短体，验证TNFAIP3复合物及其功能。
第五部分，结合酵母双杂交筛选及验证结果，验证TNFAIP3及其相互作用分子在强直性脊柱炎中的功能。扩大收集强直性脊柱炎患者临床样本，验证TNFAIP3及其靶分子在疾病发生发展过程中发挥的功能及临床意义。通过综合分析患者及健康对照样本血浆中的细胞因子表达、外周血免疫细胞功能及状态，验证TNFAIP3及其靶分子在临床炎性疾病中的作用。
研究结果
第一部分研究发现，分离外周血单个核细胞进行流式染色，TNFAIP3分子在AS外周血单核细胞中表达降低，而在淋巴细胞及粒细胞中表达无显著差异。针对与炎性疾病高度相关的Th17、Treg细胞，以及记忆性T细胞和幼稚T细胞，将T细胞进一步分群，流式分析发现TNFAIP3分子在患者及健康对照的上述细胞亚群中无显著差异。同时，将外周血单核细胞进一步分为CD14++CD16-经典型单核细胞、CD14+CD16++的非经典型单核细胞及中间型单核细胞，TNFAIP3分子在CD14+CD16++的非经典型单核细胞中表达降低尤为明显。非经典单核细胞，也称为巡逻单核细胞，是在体内分泌TNF和IL1B的重要单核细胞亚群。在非经典单核细胞中TNFAIP3分子的表达降低，表明TNFAIP3对IL1B分泌具有重要作用。
第二部分研究发现，体外单核细胞干涉TNFAIP3分子可明显促进单核细胞中IL1B及IL6表达。同时，给予NFκB抑制剂TPCK作用后，缺乏TNFAIP3引起的IL6升高可以被完全抑制，而NFκB抑制剂未能完全抑制由缺乏TNFAIP3引起的IL1B增加，提示TNFAIP3分子对IL1B的调控仅部分依赖NFκB通路。以往研究表明，单核细胞LPS活化后，IL1B分泌还需要炎性小体相关复合物对IL1B前体进行剪切处理为成熟IL1B，分泌至胞外。进一步实验发现，TNFAIP3除了能够抑制NFκB通路，还有抑制炎症小体的活化的功能。实验发现TNFAIP3在细胞中的过表达可促进LPS诱导的早期自噬小体的形成，从而抑制炎性小体(NLRP3型炎性小体)的激活，提示TNFAIP3分子能多角度多层面抑制NFκB通路相关的炎症信号活化。
第三部分研究，通过带有TNFAIP3cDNA的pGBKT7诱饵质粒转入酵母菌与携带人胚cDNA文库的酵母菌杂交，筛选出TNFAIP3相互作用蛋白。对实验结果进行分析后，初步筛选得到与TNFAIP3参与细胞自噬调节有关的潜在相互作用分子DEPTOR。
第四部分研究，通过TNFAIP3相互作用蛋白筛选，得到自噬相关分子DEPTOR，验证TNFAIP3与DEPTOR相互作用及功能。首先，通过多种实验手段发现TNFAIP3分子与DEPTOR分子存在共定位及相互作用。第二，而蛋白质降解实验证实TNFAIP3分子能够稳定DEPTOR分子。第三，在细胞内干涉DEPTOR分子发现，DEPTOR分子可以促进LPS早期自噬并抑制炎性小体生成。第四，LPS刺激早期，TNFAIP3、DEPTOR及LC3分子存在细胞内存在共定位，提示细胞中TNFAIP3-DEPTOR复合物参与自噬-炎症小体调节。另外，构建TNFAIP3分子不同结构域截短体，发现TNFAIP3分子的锌指蛋白结构域能够与DEPTOR分子相互作用，并参与自噬及炎性小体的调控。
第五部分研究发现，强直性脊柱炎患者外周血中IL6、IL1B及IL18水平较对照组上升，其中IL1B及IL18水平与非经典型单核细胞TNFAIP3表达水平存在负相关趋势，提示非经典型单核细胞中缺乏TNFAIP3表达可能与IL1B及IL18异常分泌相关。进一步通过流式分选得到非经典型单核细胞，免疫印迹实验发现AS患者外周血非经典型单核细胞TNFAIP3-DEPTOR复合物减少，自噬减弱，炎性小体活化增强，可能与外周血IL1B分泌异常相关。
结论
我们的研究表明，在单核细胞中TNFAIP3分子能够抑制IL1B分泌，这一过程部分依赖于NFκB途径。同时，TNFAIP3与DEPTOR复合物在LPS刺激的早期诱导自噬，降解炎性小体抑制IL1B分泌。强直性脊柱炎外周血非经典单核细胞中，由于TNFAIP3-DEPTOR复合物水平较低，上述自噬相关炎性小体抑制功能较弱，可能与IL1B较高水平分泌和炎症信号持续活化有关。TNFAIP3相关复合物的缺乏及其在非经典单核细胞中的功能与强直性脊柱炎患者与体内炎症环境密切相关，在疾病发生发展中发挥一定作用。另外，酵母双杂交文库筛选获得与TNFAIP3相互作用蛋白，为更加全面的了解TNFAIP3分子相关调控网络，进一步揭示其在炎性疾病中的功能提供了重要的思路和方向。
强直性脊柱炎是一种慢性自身免疫性疾病，在轴向骨骼中有严重的炎症症状，导致机体结构和功能性损伤。在我国强直性脊柱炎的患病率约为0.1-0.3%，其中男性多于女性，病因尚不清楚。强直性脊柱炎主要的治疗手段为物理治疗、药物治疗、生物制剂治疗及外科治疗，目前尚无有效的延缓疾病进程或改变强直性脊柱炎患者病变局部炎症的药物。强直性脊柱炎作为一种慢性、进展性的炎性疾病，诊断和治疗方面面临许多困难。因此，强直性脊柱炎特异性靶点的筛选及靶点相关疾病分型，对于疾病的诊断和治疗具有重要意义。
TNFAIP3，也称为A20，是调节免疫反应的重要分子，其表达缺乏与自身免疫疾病高度相关。小鼠模型中不同免疫细胞缺乏TNFAIP3分子，可出现多种自身免疫疾病，如系统性红斑狼疮，多关节炎和肠炎等。这表明TNFAIP3是自身免疫病的关键分子。TNFAIP3分子可通过调节靶分子泛素化修饰，抑制NFκB通路活性，进而抑制机体免疫功能。TNFAIP3分子上游受NFκB通路调控。当细胞受到TNF、LPS或IL1B等刺激时，NFκB通路活化，上调TNFAIP3分子表达。因此TNFAIP3是免疫反应中重要的负反馈调节因子。
目前，强直性脊柱炎的病因不明，TNFAIP3分子在人强直性脊柱炎中的作用及机制未有报道；同时，已知TNFAIP3的分子功能多集中于泛素化修饰其靶分子进而抑制NFκB通路上游活化信号传递，是否存在NFκB通路下游致炎因子分泌相关的负向调控机制目前尚未有充分认识。因此，本课题从TNFAIP3分子出发，结合强直性脊柱炎外周血表达差异分析及TNFAIP3分子相互作用复合物筛查，研究TNFAIP3分子多重负向调控炎症信号作用机制，探索TNFAIP3在强直性脊柱炎疾病发生发展中的作用及意义。
研究目标
课题研究目标主要分为五个方面：
1)分析TNFAIP3分子在强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞表达差异。
2)研究TNFAIP3分子在强直性脊柱炎差异表达细胞亚群中的免疫学功能。
3)筛选TNFAIP3分子潜在互作分子。
4)探索TNFAIP3及其相互作用分子功能及机制。
5)验证TNFAIP3及其相互作用分子在强直性脊柱炎中的功能。
研究方法
第一部分，收集强直性脊柱炎患者和健康对照外周血单个核细胞，进行表面分子标记及TNFAIP3荧光染色，利用多色流式分析，研究TNFAIP3分子在不同免疫细胞中表达差异。先将免疫细胞分为淋巴细胞、单核细胞及粒细胞三大类。针对炎性疾病高度相关的Th17、Treg细胞等进一步分群，研究TNFAIP3在AS及HC表达差异。同时，将外周血单核细胞进一步分为CD14++CD16-经典型单核细胞、CD14+CD16++的非经典型单核细胞及中间型单核细胞。根据不同免疫细胞亚群中TNFAIP3在患者及健康人群的表达差异，预测TNFAIP3在其中可能存在的功能及机制。
第二部分，根据第一部分免疫细胞亚群筛选结果，建立体外机制研究模型。通过TNFAIP3shRNA慢病毒干涉、siRNA干涉等方法，降低细胞中TNFAIP3分子表达。进一步通过ELISA、实时定量PCR、蛋白质印迹、免疫荧光、透射电子显微镜等检测方法，研究细胞中缺乏TNFAIP3分子对炎症相关信号的影响及作用机制。
第三部分，建立酵母双杂交文库筛选平台，利用带有TNFAIP3cDNA诱饵质粒酵母与人胚cDNA文库酵母进行杂交，筛选TNFAIP3潜在的相互作用分子。对筛选出的TNFAIP3相互作用分子进行分析，寻找具有免疫学功能的相互作用复合物。
第四部分，验证TNFAIP3复合物并探究其功能。通过共聚焦显微镜和共免疫沉淀及GSTpulldown等实验确定TNFAIP3相互作用复合物。对TNFAIP3复合物功能的研究，主要通过蛋白质印迹、免疫荧光和透射电子显微镜检测自噬和炎症小体活化水平。为进一步研究TNFAIP3的分子机制，建立了不同的TNFAIP3截短体，验证TNFAIP3复合物及其功能。
第五部分，结合酵母双杂交筛选及验证结果，验证TNFAIP3及其相互作用分子在强直性脊柱炎中的功能。扩大收集强直性脊柱炎患者临床样本，验证TNFAIP3及其靶分子在疾病发生发展过程中发挥的功能及临床意义。通过综合分析患者及健康对照样本血浆中的细胞因子表达、外周血免疫细胞功能及状态，验证TNFAIP3及其靶分子在临床炎性疾病中的作用。
研究结果
第一部分研究发现，分离外周血单个核细胞进行流式染色，TNFAIP3分子在AS外周血单核细胞中表达降低，而在淋巴细胞及粒细胞中表达无显著差异。针对与炎性疾病高度相关的Th17、Treg细胞，以及记忆性T细胞和幼稚T细胞，将T细胞进一步分群，流式分析发现TNFAIP3分子在患者及健康对照的上述细胞亚群中无显著差异。同时，将外周血单核细胞进一步分为CD14++CD16-经典型单核细胞、CD14+CD16++的非经典型单核细胞及中间型单核细胞，TNFAIP3分子在CD14+CD16++的非经典型单核细胞中表达降低尤为明显。非经典单核细胞，也称为巡逻单核细胞，是在体内分泌TNF和IL1B的重要单核细胞亚群。在非经典单核细胞中TNFAIP3分子的表达降低，表明TNFAIP3对IL1B分泌具有重要作用。
第二部分研究发现，体外单核细胞干涉TNFAIP3分子可明显促进单核细胞中IL1B及IL6表达。同时，给予NFκB抑制剂TPCK作用后，缺乏TNFAIP3引起的IL6升高可以被完全抑制，而NFκB抑制剂未能完全抑制由缺乏TNFAIP3引起的IL1B增加，提示TNFAIP3分子对IL1B的调控仅部分依赖NFκB通路。以往研究表明，单核细胞LPS活化后，IL1B分泌还需要炎性小体相关复合物对IL1B前体进行剪切处理为成熟IL1B，分泌至胞外。进一步实验发现，TNFAIP3除了能够抑制NFκB通路，还有抑制炎症小体的活化的功能。实验发现TNFAIP3在细胞中的过表达可促进LPS诱导的早期自噬小体的形成，从而抑制炎性小体(NLRP3型炎性小体)的激活，提示TNFAIP3分子能多角度多层面抑制NFκB通路相关的炎症信号活化。
第三部分研究，通过带有TNFAIP3cDNA的pGBKT7诱饵质粒转入酵母菌与携带人胚cDNA文库的酵母菌杂交，筛选出TNFAIP3相互作用蛋白。对实验结果进行分析后，初步筛选得到与TNFAIP3参与细胞自噬调节有关的潜在相互作用分子DEPTOR。
第四部分研究，通过TNFAIP3相互作用蛋白筛选，得到自噬相关分子DEPTOR，验证TNFAIP3与DEPTOR相互作用及功能。首先，通过多种实验手段发现TNFAIP3分子与DEPTOR分子存在共定位及相互作用。第二，而蛋白质降解实验证实TNFAIP3分子能够稳定DEPTOR分子。第三，在细胞内干涉DEPTOR分子发现，DEPTOR分子可以促进LPS早期自噬并抑制炎性小体生成。第四，LPS刺激早期，TNFAIP3、DEPTOR及LC3分子存在细胞内存在共定位，提示细胞中TNFAIP3-DEPTOR复合物参与自噬-炎症小体调节。另外，构建TNFAIP3分子不同结构域截短体，发现TNFAIP3分子的锌指蛋白结构域能够与DEPTOR分子相互作用，并参与自噬及炎性小体的调控。
第五部分研究发现，强直性脊柱炎患者外周血中IL6、IL1B及IL18水平较对照组上升，其中IL1B及IL18水平与非经典型单核细胞TNFAIP3表达水平存在负相关趋势，提示非经典型单核细胞中缺乏TNFAIP3表达可能与IL1B及IL18异常分泌相关。进一步通过流式分选得到非经典型单核细胞，免疫印迹实验发现AS患者外周血非经典型单核细胞TNFAIP3-DEPTOR复合物减少，自噬减弱，炎性小体活化增强，可能与外周血IL1B分泌异常相关。
结论
我们的研究表明，在单核细胞中TNFAIP3分子能够抑制IL1B分泌，这一过程部分依赖于NFκB途径。同时，TNFAIP3与DEPTOR复合物在LPS刺激的早期诱导自噬，降解炎性小体抑制IL1B分泌。强直性脊柱炎外周血非经典单核细胞中，由于TNFAIP3-DEPTOR复合物水平较低，上述自噬相关炎性小体抑制功能较弱，可能与IL1B较高水平分泌和炎症信号持续活化有关。TNFAIP3相关复合物的缺乏及其在非经典单核细胞中的功能与强直性脊柱炎患者与体内炎症环境密切相关，在疾病发生发展中发挥一定作用。另外，酵母双杂交文库筛选获得与TNFAIP3相互作用蛋白，为更加全面的了解TNFAIP3分子相关调控网络，进一步揭示其在炎性疾病中的功能提供了重要的思路和方向。