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研究背景:癫痫是一种慢性脑部疾病,其特征是神经元异常放电导致的大脑短暂功能障碍。尽管针对癫痫的发病机制已有大量研究,但癫痫的临床表现多种多样,其发病机制复杂,尚未完全阐明。研究表明,癫痫有时表现出家族性倾向,说明遗传因素对癫痫的形成有重要影响。此外,癫痫发作会导致大脑神经网络的持续变化,这反映在基因表达模式与细胞内和细胞间信号转导的变化上。因此,从基因角度和分子水平探索癫痫的发病机制,寻找新的癫痫治疗靶点具有重要意义。研究目的:近年研究发现,KLF4对神经系统具有重要的调控作用。然而KLF4是否与癫痫发病密切相关,目前鲜有报道。本研究基于转录因子在癫痫中的重要作用及实验室早期研究,采用行为学,分子生物学等相关实验,检测了 KLF4在戊四氮（PTZ）诱导急性癫痫模型中差异表达情况,通过海马条件性KLF4敲除探究了 KLF4生物学功能,最后结合海马条件性KLF4敲除鼠和PTZ诱导的急性癫痫寻找相关分子机制,为揭示KLF4在癫痫发病机制中的重要作用提供了一定的理论基础。研究方法:我们首先探究了 KLF4、Oct4、Sox2、c-Myc在PTZ诱导急性癫痫小鼠中的差异表达情况。实验采用ICR雄性小鼠,随机分为对照组（生理盐水）和实验组（PTZ,70mg/kg）。实验组小鼠腹腔注射70mg/kg PTZ,对照组小鼠腹腔注射同等剂量生理盐水,观察给药半小时内小鼠的癫痫行为变化。采用免疫印迹实验和RT-qPCR实验检测转录因子KLF4、Oct4、Sox2、c-Myc在前额叶皮质和海马中蛋白及mRNA表达水平的变化;采用免疫组织化学染色实验考察KLF4在海马不同亚区（CA1,CA3,DG）表达水平的改变。基于以上结果,我们进行海马条件性KLF4敲除小鼠的构建,并探究其行为表型特征。选取野生型KLF4+/+小鼠作为对照组,纯合子KLF4flox/flox小鼠作为实验组。待小鼠周龄达到6周时,进行脑立体微量定位注射,将病毒pAAV-CaMKⅡa-EGFP-P2A-Cre-WPRE注射到小鼠双侧海马中,表达3周后即完成了海马条件性KLF4敲除小鼠的构建。在病毒注射完成后的第22天进行行为学实验,并提取小鼠海马组织。通过旷场实验、Y迷宫实验、新物体识别实验、新位置识别实验、筑巢实验、埋珠实验、强迫游泳实验、糖水偏好实验和悬尾实验探究了 KLF4敲除对于小鼠行为表型的影响;通过RT-qPCR和琼脂糖凝胶电泳验证了 KLF4敲除小鼠的构建成功性以及敲除效率。通过免疫印迹实验检测了 KLF4敲除小鼠海马Oct4、Sox2、c-Myc、Iba-1、GFAP、GluA1、PSD95、NeuN、Synapsin1 的蛋白表达变化;通过RT-qPCR检测海马补体（C1qa、C1qb、C1qc、C3、C4a、C4b）mRNA的表达变化。接下来,我们进一步探究了条件性KLF4敲除小鼠在PTZ诱导的急性癫痫中的作用机制。将繁育获得的子代小鼠随机分为4组:野生型+生理盐水组、KLF4敲除+生理盐水组、野生型+PTZ（70mg/kg）组、KLF4敲除+PTZ（70mg/kg）组。其中,野生型+PTZ（70mg/kg）组和 KLF4 敲除+PTZ（70mg/kg）组小鼠均给与70mg/kgPTZ急性腹腔注射,野生型+生理盐水组、KLF4敲除+生理盐水组小鼠腹腔注射等剂量生理盐水。在注射后一小时观察小鼠癫痫情况,并记录小鼠癫痫潜伏期以及癫痫等级评分。取小鼠海马组织,通过免疫印迹实验检测GABA相关蛋白（GAD65、GAD67）表达水平变化。研究结果:1.在70mg/kg戊四唑给药后,实验组小鼠前额叶皮层和海马中KLF4蛋白和mRNA水平均呈现显著性升高。除前额叶皮层中Oct4蛋白水平显著性升高外,Oct4、Sox2、c-Myc蛋白和mRNA水平在前额叶皮层和海马中均未见显著性差异。免疫组织化学染色结果显示KLF4蛋白显著性升高主要集中在海马CA3和DG亚区。2.实验组小鼠KLF4 mRNA水平的显著下降证实了条件性KLF4敲除小鼠的成功构建。除强迫游泳实验和悬尾实验中敲除鼠不动时间显著性降低外,在其他行为学实验中均未观察到显著性差异。海马KLF4敲除显著性下调了GluA1和PSD95的表达水平,上调了 Iba-1和GFAP的表达水平,对于Oct4、Sox2、c-Myc、NeuN和Synapsin1无显著性影响。RT-qPCR结果显示:海马KLF4 敲除显著性增加了补体 C1qa、C1qb、C1qc、C3、C4a、C4b 的 mRNA 表达水平。3.海马KLF4敲除对小鼠癫痫潜伏期没有显著性影响但加重了小鼠癫痫的严重程度。KLF4敲除显著性降低了 GABA相关蛋白（GAD65、GAD67）的表达。研究结论:1.海马KLF4表达变化与PTZ诱导的急性癫痫发作密切相关。2.海马条件性KLF4敲除会促进PTZ诱发的小鼠急性癫痫发作。这可能与补体C1-C3信号通路异常激活而引起的星形胶质细胞（GFAP）和小胶质细胞的激活与突触相关蛋白（PSD95、GluA1）表达下降有关。3.GABA能系统功能下调也参与了海马条件性KLF4敲除小鼠的癫痫发作。综上,本研究为阐明转录因子KLF4在癫痫中的作用机制提供了理论依据,为开发抗癫痫新药提供了新的靶点。