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副猪嗜血杆菌(HPS, H. parasuis)是一种能引起猪的格拉瑟氏病革兰氏阴性细菌，依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸生长，，其导致的临床特征主要是纤维素性多发性浆膜炎、脑膜炎和关节炎。越南的生猪产量在世界上排名第五，到目前为止，关于越南HPS的流行病学特征、耐药性(AMR)和耐药性基因(ARGs)的流行情况尚缺乏相关数据。此外，用于预防和控制格拉瑟氏病的疫苗在越南尚未开发。本课题研究包括一下内容：
本课题第一部分主要研究了从越南中部广平省和顺化省猪场中分离到的HPS菌株的血清型流行性和毒力相关基因(VGs)的分布。我们从814个肺和鼻腔拭子样本中分离出56株HPS(6.9%).不同地区、不同年龄、不同产地标本的分离率差异有统计学意义(p<0.05)。采用一步多重PCR(mPCR)方法鉴定了这些菌株的血清型。结果表明，主要流行血清型为5型(15/56, 26.8%)，其次是血清型2型(13/56, 23.2%)和4型(10/56, 17.9%)。在这些HPS菌株中检测并分析了9个毒力相关基因(VGs)，其中vta1基因(35/56, 62.5%)检出率最高，其次是vta3基因(24/56, 42.9%)、vta2基因(22/56, 39.3%)、HPM-1371基因(20/56, 35.7%)、capD基因(17/56, 30.4%)、HPM-1372基因(7/56)以及lsgB和HPM-1373(均占8.9%)。在56个菌株中有7个(12.5%)没有携带本研究中检测的VGs基因。发现部分血清型与VGs存在较强的相关性，其中与毒力相关的基因HMP-1371、HMP-1372、vta3、vta2、capD主要集中在在血清型5/12型菌株中，vta2主要集中在血清型2型菌株中。本研究的结果是首次提供越南中部猪HPS分离株流行病学特征。
本课题第二部分研究目的是分析已分离的56株HPS菌株中AMR的分布及其与ARG的关联性。本研究使用肉汤微稀释法检测所有菌株对25种抗菌剂的AMR，并通过PCR方法鉴定ARG的存在，研究表明，这些菌株对甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲恶唑的耐药率较高(94.6%),其次是粘菌素(91.1%)、氯霉素(91.1%)、青霉素(85.7%)、庆大霉素(83.9%)、林可霉素(82.1%)和阿莫西林(78.6%)。所有菌株均对至少三到十八种不同抗菌剂具有多重耐药性(MDR)。每种抗菌药物的耐药表型至少与另一种抗菌药物相关；除阿莫西林和妥布霉素外，其余指标均为正相关性。在分离的菌株中，最常见的ARGs是blaTEM-1(94.6%)、int(76.8%)、gyrA(58.9%)和rmtD(50.0%)。tetB-tetH(OR=153.0,p=0.001),tetA和tetB(OR=75.0,p=0.001), tetH和aac(6’)-Ib(OR=49.0,p=0.003),aadA1和tetB(OR=23,p<0.01),aac(6’)-Ib和sulII,parC和erm(A)((OR=23.0,p<0.01)相关性最强。头孢呋辛、氯霉素和妥布霉素耐药分别与blarob-1(OR=26.3,95%CI2.7-255.7,p=0.002)、catl(OR=25.1,95%CI2.4-258.9,p=0.004)和strB(OR=23.5,95%CI2.6-212.6,p=0.001)密切相关。本研究结果表明，从越南中部的猪中分离的副猪嗜血杆菌AMR的流行情况略高，一些AMR表型与相关ARGs高度相关。在越南中部地区首次发现HPS抗生素耐药性将有助于格拉瑟氏病的临床控制，以及制定政策和临床实践指南，为减少越南养猪生产中的抗生素耐药性。
在第三部分研究中，从中国华北地区猪场中分离到一株高毒力HPS血清型5型菌株SH0165，在37℃(H37)和40℃(H40)分别在体外连续传代250次。采用Bio-screenC系统和动物(豚鼠或仔猪)感染模型分别测定不同代菌株的生长情况和毒力。结果表明，亲本菌株的生长速度明显慢于亚菌株(p<0.01)。豚鼠感染试验中,所有感染了亲本菌株和H37-100(在37℃连续传100代的菌株)的动物均在感染后36-48h内死亡，尸体剖检可见包括腹膜炎、心膜炎，关节炎，脑膜炎。相比之下，H37-150、H37-200、H37-250、H40-150、H40-200和H40-250的毒力明显减弱，感染后72h豚鼠的存活率分别为20.0%、60.0%、80.0%、20.0%、40.0%和80.0%。在仔猪感染试验中，感染了亲本、H37-150和H37-200毒株后致死率达20.0%，并带有明显的临床症状和病变。H37-200、H37-250、H40-150、H40-200和H40-250亚株感染仔猪的肺和脑组织中HPS的载菌量显著低于感染亲本菌株的仔猪(p<0.01)。这是首次关于体外连续传代的HPS毒株毒性明显减弱的报道，为HPS弱毒疫苗的开发提供新的依据。
在第四部分研究中，我们使用豚鼠感染模型评估了中国商品化的HPS血清型4型和5型二价灭活的疫苗对越南的HPS血清型4型和5型分离株预防的效果。豚鼠免疫后血清中？抗体、IFN-γ和IL-4水平显著升高。与未接种疫苗的动物相比，接种商品化疫苗的豚鼠在越南分离毒株感染后，其脑、肺和肝脏组织的损伤评分明显较轻，载菌量也较低。在未接种疫苗的豚鼠中观察到了典型的格拉瑟氏病症状。综上所述，我们的数据表明，由中国商品化的HPS血清型4型和5型二价灭活的疫苗可以很好地预防来自越南的同源毒株的感染。
本课题第一部分主要研究了从越南中部广平省和顺化省猪场中分离到的HPS菌株的血清型流行性和毒力相关基因(VGs)的分布。我们从814个肺和鼻腔拭子样本中分离出56株HPS(6.9%).不同地区、不同年龄、不同产地标本的分离率差异有统计学意义(p<0.05)。采用一步多重PCR(mPCR)方法鉴定了这些菌株的血清型。结果表明，主要流行血清型为5型(15/56, 26.8%)，其次是血清型2型(13/56, 23.2%)和4型(10/56, 17.9%)。在这些HPS菌株中检测并分析了9个毒力相关基因(VGs)，其中vta1基因(35/56, 62.5%)检出率最高，其次是vta3基因(24/56, 42.9%)、vta2基因(22/56, 39.3%)、HPM-1371基因(20/56, 35.7%)、capD基因(17/56, 30.4%)、HPM-1372基因(7/56)以及lsgB和HPM-1373(均占8.9%)。在56个菌株中有7个(12.5%)没有携带本研究中检测的VGs基因。发现部分血清型与VGs存在较强的相关性，其中与毒力相关的基因HMP-1371、HMP-1372、vta3、vta2、capD主要集中在在血清型5/12型菌株中，vta2主要集中在血清型2型菌株中。本研究的结果是首次提供越南中部猪HPS分离株流行病学特征。
本课题第二部分研究目的是分析已分离的56株HPS菌株中AMR的分布及其与ARG的关联性。本研究使用肉汤微稀释法检测所有菌株对25种抗菌剂的AMR，并通过PCR方法鉴定ARG的存在，研究表明，这些菌株对甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲恶唑的耐药率较高(94.6%),其次是粘菌素(91.1%)、氯霉素(91.1%)、青霉素(85.7%)、庆大霉素(83.9%)、林可霉素(82.1%)和阿莫西林(78.6%)。所有菌株均对至少三到十八种不同抗菌剂具有多重耐药性(MDR)。每种抗菌药物的耐药表型至少与另一种抗菌药物相关；除阿莫西林和妥布霉素外，其余指标均为正相关性。在分离的菌株中，最常见的ARGs是blaTEM-1(94.6%)、int(76.8%)、gyrA(58.9%)和rmtD(50.0%)。tetB-tetH(OR=153.0,p=0.001),tetA和tetB(OR=75.0,p=0.001), tetH和aac(6’)-Ib(OR=49.0,p=0.003),aadA1和tetB(OR=23,p<0.01),aac(6’)-Ib和sulII,parC和erm(A)((OR=23.0,p<0.01)相关性最强。头孢呋辛、氯霉素和妥布霉素耐药分别与blarob-1(OR=26.3,95%CI2.7-255.7,p=0.002)、catl(OR=25.1,95%CI2.4-258.9,p=0.004)和strB(OR=23.5,95%CI2.6-212.6,p=0.001)密切相关。本研究结果表明，从越南中部的猪中分离的副猪嗜血杆菌AMR的流行情况略高，一些AMR表型与相关ARGs高度相关。在越南中部地区首次发现HPS抗生素耐药性将有助于格拉瑟氏病的临床控制，以及制定政策和临床实践指南，为减少越南养猪生产中的抗生素耐药性。
在第三部分研究中，从中国华北地区猪场中分离到一株高毒力HPS血清型5型菌株SH0165，在37℃(H37)和40℃(H40)分别在体外连续传代250次。采用Bio-screenC系统和动物(豚鼠或仔猪)感染模型分别测定不同代菌株的生长情况和毒力。结果表明，亲本菌株的生长速度明显慢于亚菌株(p<0.01)。豚鼠感染试验中,所有感染了亲本菌株和H37-100(在37℃连续传100代的菌株)的动物均在感染后36-48h内死亡，尸体剖检可见包括腹膜炎、心膜炎，关节炎，脑膜炎。相比之下，H37-150、H37-200、H37-250、H40-150、H40-200和H40-250的毒力明显减弱，感染后72h豚鼠的存活率分别为20.0%、60.0%、80.0%、20.0%、40.0%和80.0%。在仔猪感染试验中，感染了亲本、H37-150和H37-200毒株后致死率达20.0%，并带有明显的临床症状和病变。H37-200、H37-250、H40-150、H40-200和H40-250亚株感染仔猪的肺和脑组织中HPS的载菌量显著低于感染亲本菌株的仔猪(p<0.01)。这是首次关于体外连续传代的HPS毒株毒性明显减弱的报道，为HPS弱毒疫苗的开发提供新的依据。
在第四部分研究中，我们使用豚鼠感染模型评估了中国商品化的HPS血清型4型和5型二价灭活的疫苗对越南的HPS血清型4型和5型分离株预防的效果。豚鼠免疫后血清中？抗体、IFN-γ和IL-4水平显著升高。与未接种疫苗的动物相比，接种商品化疫苗的豚鼠在越南分离毒株感染后，其脑、肺和肝脏组织的损伤评分明显较轻，载菌量也较低。在未接种疫苗的豚鼠中观察到了典型的格拉瑟氏病症状。综上所述，我们的数据表明，由中国商品化的HPS血清型4型和5型二价灭活的疫苗可以很好地预防来自越南的同源毒株的感染。