人尿中α<,1>微球蛋白的纯化鉴定和多克隆抗体制备及人α<,1>微球蛋白在大肠杆菌中的表达

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我们用硫酸铵分级沉淀,亲和层析,Q-sepharose Fast Flow阴离子交换层折,superdex G-75凝胶过滤等步骤从人尿中分离纯化α1-MG,得到蛋白纯品.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳经银染呈单一条带,质谱分析及同源序列比较确定为人α1-MG.用纯化的蛋白免疫动物获得了多克隆抗体,为国产α1-MG免疫学测定试剂的研发奠定了基础.由于从病人尿标本中提取天然α1-MG步骤繁琐,成本高,回收率低,因此我们又采用基因工程的方法,利用巢式PCR的方法从正常人肝细胞中扩增出α<,1>-MG基因,将其克隆到原核表达载体中,在大肠杆菌中实现了α<,1>微球蛋白的表达,经过克隆筛选和鉴定获得了正确克隆,IPTG诱导后得到带有6个组氨酸标签的α<,1>-MG融合蛋白,每升细菌中含20mg目的蛋白.
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