【摘 要】
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羊奶中含有丰富的短、中链脂肪酸和长链多不饱和脂肪酸,可以满足人体对必需脂肪酸的需求。Micro RNA（miRNA）是一类对有机体多种生命活动都具有调控作用的表观调控因子,可以影响脂肪酸代谢关键基因的表达进而发挥调节脂肪酸代谢的功能。先前研究用过表达方法初步揭示了miR-103对山羊乳腺上皮细胞脂肪酸代谢的影响,但效率较低、作用时效较短。因此,选择先进的研究手段来解析miR-103对于脂代谢的分子
【基金项目】
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国家自然科学基金（No.31772575）；
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羊奶中含有丰富的短、中链脂肪酸和长链多不饱和脂肪酸,可以满足人体对必需脂肪酸的需求。Micro RNA（miRNA）是一类对有机体多种生命活动都具有调控作用的表观调控因子,可以影响脂肪酸代谢关键基因的表达进而发挥调节脂肪酸代谢的功能。先前研究用过表达方法初步揭示了miR-103对山羊乳腺上皮细胞脂肪酸代谢的影响,但效率较低、作用时效较短。因此,选择先进的研究手段来解析miR-103对于脂代谢的分子机理和羊奶品质调控技术研究具有重要意义。CRISPR/Cas9技术是一种高效、便捷的基因编辑技术,随着不断的成熟和完善,其中双sg RNA敲除载体已被证实在切割效率上优于单sg RNA敲除载体。本研究根据pre-miR-103序列设计sg RNAs,构建靶向miR-103的双sg RNA敲除载体,转染山羊乳腺上皮细胞,利用CRISPR/Cas9技术获得miR-103敲除的乳腺上皮细胞,探究其在山羊乳腺上皮细胞脂肪酸代谢过程中的作用。研究结果如下:1.成功构建miR-103 CRISPR/Cas9双sg RNA敲除载体。本研究根据pre-miR-103序列设计并选择了四个评分较高的sg RNAs（sg RNA1、sg RNA2、sg RNA3与sg RNA4）用于单sg RNA敲除载体的构建。在此基础上选择靠近pre-miR-103序列两端的sg RNAs构建了四组双sg RNA敲除载体（sg RNA2-1、sg RNA2-4、sg RNA3-1和sg RNA3-4）,转染山羊乳腺上皮细胞经嘌呤霉素筛选得到单克隆细胞株并作为后续试验的材料。2.miR-103敲除的单克隆细胞鉴定及脱靶位点分析。通过对单克隆细胞的敲除鉴定,得到了一株在第一个位点缺失一个核苷酸,在第二个位点缺失两个核苷酸并且增加七个核苷酸的miR-103敲除单克隆细胞株,在m RNA水平上miR-103-3p表达降低63.69%（P＜0.01）,通过T7EN1酶切鉴定表明该敲除细胞株并未发生脱靶现象。3.miR-103敲除对山羊乳腺上皮细胞脂肪酸代谢的影响。（1）miR-103敲除显著抑制细胞中脂滴、甘油三酯和胆固醇的生成（P＜0.05）;（2）miR-103敲除显著影响脂肪酸组成与含量:细胞内长链饱和脂肪酸中,C16:0与C17:0上调而C20:0下调;不饱和脂肪酸中,C16:1、C17:1、C20:3、C20:4、C20:5、C22:6上调而C18:1与C18:2下调（P＜0.05）;（3）miR-103敲除显著影响脂肪酸代谢相关基因的表达:miR-103敲除显著抑制甘油三酯合成（DGAT1、DGAT2和AGPAT6）及脂滴形成（XDH和TIP47）关键基因的表达（P＜0.05）,脂肪酸活化及转运（ACSL1、ACSS2和FABP3）基因m RNA表达水平在敲除细胞中显著升高（P＜0.01）,脂肪酸去饱和与延伸（FADS1与FADS2）基因m RNA表达水平在敲除细胞中显著下降（P＜0.05）而ELOVL5与ELOVL6基因m RNA表达水平在敲除细胞中显著上升（P＜0.05）,脂肪酸从头合成（ACACA与FASN）基因m RNA表达水平在敲除细胞中显著降低（P＜0.05）,转录调节因子中INSIG1、INSIG2、C/EBPβ、SREBP1a、SREBP2、SREBP1c、PPARG和LXRA的m RNA表达水平在敲除细胞中显著下降（P＜0.05）,脂肪酸氧化（ATGL、ACOX1、CPT1A和HSL）基因m RNA表达水平在敲除细胞中显著降低（P＜0.05）。综上所述,敲除miR-103可以抑制山羊乳腺上皮细胞中脂滴、甘油三酯和胆固醇的含量,并且影响脂代谢相关基因的表达进而影响细胞中脂肪酸含量,为研究miR-103提高羊奶的营养价值提供了理论依据。
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