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研究一:糖尿病肾病患者肾小球转录组学数据分析研究背景2型糖尿病肾病(DN)是导致终末期肾脏疾病的主要原因,尽管近年来其分子机制被广泛研究,但是仍然未找到十分有效的干预措施和治疗靶点延缓疾病的进展。研究方法本研究尝试从61例不同疾病分期的糖尿病肾病患者及20例癌旁对照中显微微分离肾活检组织获得肾小球,利用Affymetrix?microarray platform(Human Transcriptome Array 2.0,HTA 2.0)得到全基因组转录组学数据,经过RMA算法预处理(log2转换),获得79个样本和18418个基因表达。进一步收集患者的临床表型,包括24小时尿蛋白定量,血清肌酐,估计肾小球滤过率(eGFR)资料。进行差异表达基因和权重基因共表达网络分析(WGCNA)。研究结果研究发现早期的糖尿病肾病患者(ACR<200μg/ml,并且eGFR>90ml/min/1.73m2)主要表现为代谢异常(metabolic process),而晚期的糖尿病肾病(eGFR<60ml/min/1.73m2)主要涉及AGE-RAGE信号通路的活化和细胞外基质的形成和降解通路(extracellular matrix organization and degradation)相关。进一步WGCNA进行分层聚类共获得18个基因模块,结合临床表型eGFR和蛋白尿的相关分析提示 Turquoise[eGFR(r=0.65,P=10-7)和蛋白尿(r=-0.8,p=10-13)]、Red[eGFR(r=-0.73,p=10-10)和蛋白尿(r=0.79,p=10-11)]和 Green[eGFR(r=-0.7,p=10-9)和蛋白尿(r=-0.83,p=10-15)]模块和临床表型具有显著相关。基因功能分析提示Turquoise模块与细胞骨架的形成和迁移有关,且富集肾小球上皮细胞(足细胞)特异性表达基因;Red模块提示天然免疫反应,Green模块提示细胞外基质的形成和DN疾病的发生和发展密切相关。研究结论本研究首次揭示了 DN疾病进展过程中转录水平的特征,提出足细胞骨架的形成和迁移、天然免疫反应及细胞外基质形成在糖尿病肾病的疾病过程中起着重要作用,而模块中的hub基因为关键基因,值得进一步功能分析和机制研究,有望成为干预的靶点。研究二:Slit-roboGTP activating protein 2(srGAP2a)维持足细胞结构和功能的研究研究背景足细胞是位于肾小球一类特殊的上皮细胞,对维持肾小球滤过屏障及足突的完整结构起着重要的作用。在肾功能不全特别是糖尿病肾病(DN)状态下,足细胞细胞骨架出现严重的重排和破坏。然而,目前导致足细胞骨架损伤的骨架相关蛋白分子以及作用机制并不完全清楚。我们利用DN肾小球转录组学数据(见研究一)分析发现Slit-Robo GTP激活蛋白2a(srGAP2a)与DN临床表型蛋白尿和eGFR密切相关,又是Turquoise模块中hub基因。但是,srGAP2a在肾小球中功能目前尚无报道。研究方法首先利用realtime和免疫荧光技术来验证人肾小球足细胞中srGAP2a的mRNA和蛋白水平;利用体外培养的人足细胞分别给予高糖(30mM)、TGFβl(5ng/ml)干预以及敲低(knowdown)和过表达(overexpression)来明确srGAP2a对足细胞细胞骨架和细胞迁移的影响。利用斑马鱼模型明确srGAP2a对维持足细胞形态和结构的影响,利用2型糖尿病模型小鼠(db/db)给予外源性过表达srGAP2a观察其是否具有缓解足细胞损伤的作用。进一步利用原位邻位连接技术(insitUPLA),免疫共沉淀(Co-IP)和GST-pulldown技术来明确足细胞中srGAP2a对Rho GTPase,RhoA,Cdc42和Rac1的调节方式。研究结果研究发现srGAP2a在人和小鼠足细胞中特异性表达,与足细胞标志蛋白synaptopodin共定位,且DN患者和db/db小鼠肾小球中表达显著下降。体外研究发现给高糖和TGFβ1刺激可以诱导srGAP2a表达下降,呈时间依赖。体外培养人足细胞敲低srGAP2a后出现细胞骨架蛋白F-actin减少,划痕实验和迁移实验提示足细胞迁移增加。外源性过表达srGAP2a后可以逆转高糖和TGF|31诱导的细胞骨架破坏。体内斑马鱼实验提示srGAP2a给予吗啉代反义寡核苷酸(MO)敲低后出现眼周和身体水肿,电镜下出现足突融合。2型糖尿病模型小鼠(db/db)给予尾静脉注射srGAP2a过表达病毒,可以缓解蛋白尿和足突的融合。进一步insituPLA研究发现,无论在人肾小球还是体外培养足细胞中,srGAP2a可以特异性与Rho GTPase的RhoA,Cdc42结合,而不能与Rac结合,Co-IP结果与之类似。GST-pulldown技术提示在高糖和TGFβ刺激下,srGAP2a具有抑制RhoA和Cdc42的活性,反之,敲低内源性srGAP2a,RhoA和Cdc42的活性增加。研究结论:本课题首次报道了 srGAP2a蛋白在肾小球足细胞中特异性高表达,对维持足细胞细胞骨架的稳定起着重要作用,其主要机制是通过抑制RhoA和Cdc42的过度活化来稳定F-actin。在DN状态下,srGAP2a的显著下调,可能促使RhoA和Cdc42活性增加,从而出现足细胞迁移增加,骨架重排,进而足细胞从基底膜上脱落。外源性给予srGAP2a可以缓解DN的足细胞损伤和蛋白尿的产生,提示srGAP2a可能成为治疗的靶点。