镉(Cadmium,Cd)是环境中主要的重金属污染物之一,其毒性较大,蓄积性强,能够在生物体中传递、积累,造成生物有机体中细胞氧化损伤、细胞凋亡、组织坏死等一系列负面效应,从而影响生物体的正常生长发育和后代适合度。但是当生物体受到重金属胁迫时,机体自身会产生相应的机制来抵抗或减缓重金属应激,从而减少机体的损伤,将有害物质排出体外,维持机体内环境稳态,其中热激蛋白基因的表达就属于一种防御机制。热激蛋白(Heat shock protein,Hsps)是生物体适应环境变化的一个重要媒介,不仅涵盖高温热激单方面的生物学意义,而且在应对重金属污染逆境条件下也会产生相应的应激改变来适应环境。本论文以巴西龟(Trachemys scripta elegans)为实验对象,研究巴西龟胚胎时期经镉染毒后,镉对后代幼体形态生理和行为学的影响和巴西龟幼体染毒镉96小时后的半致死剂量以及在不同染毒剂量和不同染毒时间下巴西龟6个组织中热激蛋白基因hsc70和hsp90mRNA相对表达量的变化。在探究镉对巴西龟幼体后代表型形态和行为运动表现的影响时,我们设定4个镉剂量,分别为每千克孵卵基质中含镉量为0 mg,25 mg,50 mg,100 mg,对巴西龟孵进行染毒处理。研究结果显示孵化基质中不同Cd剂量处理下,卵的孵化成功率不同,差异显著。以卵重为协变量ANCOVA结果显示,孵卵基质中不同Cd剂量组间的初生幼体形态特征背甲长和腹甲长有显著差异,体重、背甲宽和腹甲宽无显著差异。幼体饲养至80天时,测量形态特征和测定运动表现,结果显示随着饲养天数增加,各组间幼体体重没有显著增长,但是背甲长、背甲宽、腹甲长和腹甲宽均显著性增长;80天时不同Cd剂量处理组间幼体形态特征没有显著差异,但是运动的最大距离和疾速度有显著差异,且随着Cd染毒剂量增大,其幼体的最大距离减小,疾速度减小。综上表明镉胁迫巴西龟胚胎会影响其幼体后代的形态以及后代的运动表现。在探究巴西龟对镉的敏感性,以及镉急性染毒巴西龟幼体96小时后的半数致死剂量(96 h-LD50)时,采用腹腔注射法,将不同镉剂量注入动物体内,统计染毒96小时后不同镉剂量组巴西龟幼体的死亡数,通过线性回归和寇式法两种方法计算镉急性染毒巴西龟96小时后的半数致死剂量。结果显示,巴西龟经镉染毒后,出现了明显的病变症状且寿命缩短。通过线性回归法计算得到的96小时急性镉暴露半致死剂量LD50为13.69 mg/kg;通过寇式法计算得到的96小时的镉半致死剂量LD50为13.44 mg/kg,两种方法计算的结果没有显著差异。此结果为下一个研究阶段提供了剂量设定依据,为评价镉对巴西龟幼体产生的毒性,以及后续的分子实验提供理论依据。应用实时荧光定量PCR(R-T qPCR)技术定量检测不同Cd剂量对巴西龟幼体6个组织中热激蛋白基因hsc70和hsp90 mRNA相对表达量的影响。依据半数致死剂量将染毒剂量设定为每千克体重中含Cd 0 mg,3.49 mg,7.24 mg和10.42 mg,经镉染毒96小时后,依次检测幼体肝脏、肾脏、肌肉、肺、大脑和心脏中hsc70和hsp90基因的mRNA表达量变化。结果显示染毒镉96小时后,不同Cd剂量对巴西龟幼体肝脏、肾脏和大脑中的hsc70mRNA相对表达量均有显著差异,Cd剂量为7.24 mg/kg组中hsc70 mRNA表达量显著高于其他剂量组,而且相比对照组,表达量先上升后下降。其余肌肉、肺和心脏3个组织中hsc70mRNA表达量受Cd剂量变化的影响不显著。不同Cd剂量对6个组织中的hsp90 mRNA表达量的影响仅在肝脏组织中受显著影响。此外,通过比较相同Cd剂量下6个组织中基因的mRNA相对表达量,发现96小时后对照组不同组织间hs和hsc70和hsp90mRNA的表达量也是有差异的,这说明正常情况下,巴西龟幼体不同组织中不同基因表达量也是不同的。其中,肾脏和大脑中hsc70 mRNA表达水平高于其他4个组织;大脑中hsp90表达水平高于其他5个组织;Cd剂量为3.49 mg/kg时,hsc70同样也是在大脑和肾脏中表达水平高于其他4个组织,hsp90在大脑中表达量高于其他5个组织;而在7.24 mg/kg和10.42 mg/kg Cd剂量下hsc70和hsp90 mRNA表达量在不同组织间都没有显著变化。总之,结果说明肝脏、肾脏和大脑3个组织比其他组织受镉诱导敏感,且随着Cd剂量的增加,镉毒性作用渐渐减弱,这可能是巴西龟之所以作为入侵物种,其自身较强的防御功能所在。选取同一 Cd剂量为7.24 mg/kg来研究不同镉染毒时间对巴西龟幼体6个组织中hsc70和hsp90 mRNA相对表达量的影响,结果显示随着染毒时间的延长,肝脏中hsc70 mRNA转录水平升高,且在胁迫12 h时与对照组相比显著升高,在96 h时表达量达到最大值;而染毒时间对hsp90表达没有显著差异;肾脏中hsc70mRNA转录水平随着染毒时间延长,转录水平显著升高,hsp90在染毒24 h时表达量显著高于其他时间;肌肉中hsc70随着时间的延长表达量显著升高,在96 h时达到显著性高峰;hsp90转录水平同样随着染毒时间延长表达水平显著升高,且72 h和96 h表达量显著高于其他时间;肺中hsc70随着Cd染毒时间的延长表达量显著升高,在96 h时达到显著性高峰,hsp90转录水平在染毒24 h时开始有显著升高;大脑中hsc70mRNA随着Cd染毒时间的延长表达量显著升高,在胁迫96 h时达到显著性高峰,hsp90在胁迫24 h时相比对照组显著升高,在染毒24 h和72 h时表达量显著高于其他时间组;心脏中hsc70 mRNA转录水平随染毒时间的延长而显著升高,在胁迫96 h时达到显著性高峰,hsp90在染毒24 h其表达量显著高于其他时间组。因此,总的来说通过对不同染毒时间两种基因表达量变化影响来看,肝脏中hsc70比hsp90更容易受到Cd的诱导,这可能说明hsc70在肝脏应对Cd毒性作用的生理机制中发挥着更重要的作用;而其他组织中hsc70和hsp90没有明显的敏感性比较。综上所述,镉确实会对巴西龟胚胎产生毒性,并且对后代形态和行为学表现产生影响;镉急性染毒巴西龟幼体可诱使其寿命缩短;镉确实诱导巴西龟幼体组织中hsc70和hsp90基因mRNA表达量发生变化,但是幼体在不同Cd染毒剂量下毒性效应不同;不同组织受到Cd的毒性也是不相同的;染毒时间不同,效应也不同,因此表明镉诱导hsp的变化呈-剂量-组织-时间依赖性。也就是说镉对巴西龟产生的毒性取决于镉剂量、染毒时间以及机体不同组织等综合因素作用的结果。此外,hsc70和hsp90 mRNA表达量上调表明热激蛋白Hsps在巴西龟应对镉应激时起着重要的保护作用。