【摘 要】
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研究背景:卵巢癌是女性生殖系统中常见的恶性肿瘤之一,是女性生殖系统恶性肿瘤的头号杀手。目前临床上主要以肿瘤细胞减灭术结合以铂为基础的联合化疗作为卵巢癌基本治疗方案。其中,顺铂能够有效抑制妇科手术无法切除或者远端转移的肿瘤细胞的生长,对改善患者预后起到关键作用。然而,化疗耐药的出现制约了顺铂的治疗效果,严重影响卵巢癌患者5年生存率。因此,解决顺铂耐药问题一直是卵巢癌临床治疗中需要攻克的难点和重点。根
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研究背景:卵巢癌是女性生殖系统中常见的恶性肿瘤之一,是女性生殖系统恶性肿瘤的头号杀手。目前临床上主要以肿瘤细胞减灭术结合以铂为基础的联合化疗作为卵巢癌基本治疗方案。其中,顺铂能够有效抑制妇科手术无法切除或者远端转移的肿瘤细胞的生长,对改善患者预后起到关键作用。然而,化疗耐药的出现制约了顺铂的治疗效果,严重影响卵巢癌患者5年生存率。因此,解决顺铂耐药问题一直是卵巢癌临床治疗中需要攻克的难点和重点。根据传统中医药理论发现,紫草具有补中益气、散瘀、活血等功效,与现代医家认为的卵巢癌正气不足、血瘀、气滞等病机不谋而合。现代医学研究表明,紫草除本身具有抗病原微生物、抗炎、抗过敏、保肝等作用外,其提取物亦具有广泛的抗肿瘤作用。其中,紫草素作为一种从紫草中提取分离的萘醌类化合物,目前已展现极具潜力的抗肿瘤活性。课题组前期研究发现,紫草素联合顺铂具有抑制卵巢癌顺铂耐药细胞生长的作用。此外,我们还发现细胞经两药联合处理后,铁死亡关键指标Fe2+水平显著升高,提示紫草素联合顺铂可能通过铁死亡途径发挥上述作用。因此,基于前人研究和课题组前期研究发现,本篇论文主要围绕紫草素联合顺铂通过铁死亡途径克服卵巢癌顺铂耐药的作用及机制展开研究。目的:本研究将通过分子生物学、实验动物学等实验手段,探究紫草素联合顺铂克服卵巢癌顺铂耐药的作用及其机制:（1）建立卵巢癌顺铂耐药细胞株;（2）明确紫草素联合顺铂抑制卵巢癌顺铂耐药细胞的作用;（3）明确卵巢癌顺铂耐药细胞中紫草素联合顺铂诱导铁死亡的机制。方法:（1）顺铂浓度递增法诱导并建立卵巢癌顺铂耐药细胞株,并通过CCK8法比较耐药株与亲本株的耐药指数;（2）CCK8法探究紫草素对不同卵巢癌顺铂耐药细胞株顺铂敏感性的影响;（3）两药协同实验探究紫草素与顺铂的协同效应,并计算各药物浓度对应的联合指数;（4）克隆形成实验探究紫草素联合顺铂对卵巢癌顺铂耐药细胞的抑制作用;（5）裸小鼠皮下移植瘤实验探究两药联合抗顺铂耐药卵巢癌的作用;（6）通过检测生化指标ALT、AST、CRE和BUN评估两药联合可能存在的肝肾毒性;（7）采用Q-Exactive＆Orbitrap Exploris480双质谱平台结合DDA＆PRM双技术探究两药联合克服卵巢癌顺铂耐药的可能机制;（8）利用ROS荧光探针和脂质过氧化物荧光探针结合流式细胞术探究两药联合对卵巢癌顺铂耐药细胞ROS和脂质过氧化物水平的影响;（9）利用二价铁离子荧光探针结合激光共聚焦技术评估两药联合对二价铁离子水平的影响;（10）利用铁死亡抑制剂Fer-1和铁离子螯合剂DFO探究两药联合是否通过铁离子累积诱导细胞铁死亡;（11）Western Blot和免疫组化实验检测铁死亡相关蛋白;（12）HMOX1抑制剂ZnPP和siRNA实验探究两药联合是否通过HMOX1诱导细胞铁死亡。结果:（1）浓度递增法建立了卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780/DDP、OVCAR4/DDP和SKOV3/DDP,与亲本株相比耐药指数均大于3;（2）低浓度紫草素即可增加顺铂耐药型卵巢癌细胞对顺铂的敏感性;（3）在一定浓度条件下紫草素和顺铂可表现出协同作用,且在上述不同耐药株中表现相近;（4）体内实验结果显示0.8 mg/kg紫草素联合3 mg/kg顺铂具有克服卵巢癌顺铂耐药的作用;（5）蛋白组学实验结果表明紫草素联合顺铂可能通过诱导细胞铁死亡克服卵巢癌顺铂耐药;（6）靶向蛋白组学定量结果表明两药联合可能通过铁离子代谢途径诱导铁死亡;（7）两药联合显著增加A2780/DDP细胞脂质过氧化、ROS、二价铁离子和总铁离子水平,同时降低GPX4蛋白水平;（8）两药联合诱导的细胞铁死亡可被铁死亡抑制剂Fer-1和二价铁离子螯合剂DFO所抑制;（9）两药联合显著增加A2780/DDP细胞铁离子代谢相关基因的转录和表达;（10）抑制或干扰A2780/DDP细胞中HMOX1可抑制两药联合所诱导的铁死亡;（11）siRNA干扰HMOX1可显著性降低两药联合所累积的二价铁离子水平。结论:（1）体内外实验结果表明,紫草素联合顺铂具有克服卵巢癌顺铂耐药的作用;（2）蛋白组学实验发现,两药联合可能通过上调铁离子代谢相关蛋白的表达诱导铁死亡,进而发挥上述作用;（3）分子生物学实验发现,两药联合通过上调HMOX1促进二价铁离子累积,从而诱导铁死亡。
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