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叶片衰老由多种事件调控。近年来,研究表明,CTK(Cytokinin)在维持叶片的持绿方面的效果显著,但其在水稻中调控叶片持绿的机理尚不明确,本次研究主要是以本实验室选育的高世代籼型稳定的不同衰老表型水稻为研究对象,以其发育后期的叶片作为研究材料,研究了不同衰老表型水稻及其不同发育阶段叶片中Chl和CTK的含量变化;Chl、CTK代谢相关基因以及相关信号转导、衰老相关基因、转录因子、持绿或早衰基因、自噬基因、受体激酶等基因的表达变化,以探寻CTK调控水稻叶片衰老的生理及分子机制。研究结果表明:1.不同水稻发育后期表观结果显示,2474、1923品种具有叶绿籽黄的表型,界定为迟衰(SGR)品种;2101、2314、1915品种具有叶黄籽黄的表型,界定为早衰(ESR)品种。2.对不同水稻品种乳熟期(R期)、乳熟蜡熟期(RL期)、蜡熟期(L期)、完熟期(W期)叶绿素含量测定分析的结果表明:随着发育进程的延伸,五个品种叶绿素含量均呈现下降趋势。其中,SGR品种(2474、1923)叶绿素含量在L期以后下降缓慢,其叶绿素含量始终维持在较高水平;ESR品种(2314、2101)叶绿素含量下降速率快,至成熟时其叶绿素含量均降至较低水平。实验结果说明,SGR品种(2474、1923)及ESR品种(2314、2101)后期叶绿素含量与其叶绿籽黄表型具有较高匹配度,1915品种叶绿素含量下降水平居中,研究中将其归入ESR品种类型。3.对不同水稻品种R期、RL期、L期、W期叶绿素代谢相关基因表达量分析结果表明,随着发育进程的延伸,SGR品种的两个叶绿素合成相关基因(HEMA、GSA)在四个时期的平均表达量均高于ESR品种;2474品种的叶绿素降解相关基因(NYC4、NYC3、SGR)在其四个时期内平均表达量均低于ESR品种。其中,1923品种两个叶绿素合成相关基因表达量的平均值相对ESR品种增加的倍数是三个叶绿素降解相关基因平均值的2.47倍。推测叶绿素合成速率高于叶绿素降解速率可能是维持SGR品种持绿的直接原因。4.对不同水稻品种R期、RL期、L期、W期的内源激素含量测定分析结果表明,随着发育进程的延伸,五个品种的细胞分裂素(ZT、CZ)含量均呈现下降趋势,其中,SGR品种的ZT、CZ含量在所有时期内始终维持在较高水平;ESR品种与其相反,其ZT、CZ的含量在所有时期内始终较低。通过对五个品种四个时期叶绿素含量分别与ZT、CZ、i PA含量相关性拟合分析表明,五个品种各个时期叶绿素含量与CZ含量相关性显著,P<0.05,没有达到极显著相关,而与ZT、i PA含量相关性不显著P>0.05。具体而言,五个品种四个时期叶绿素含量与CZ含量相关性为0.954;而与ZT、i PA含量相关性分别为0.918、0.779(图3-4)。以上结果说明,水稻叶绿素与CZ含量变化具有相关性,相关性没有达到极显著,与ZT、i PA含量不具显著性5.对不同水稻品种R期、RL期、L期、W期CTK代谢相关基因表达量分析结果表明,随着发育进程的延伸,SGR品种四个时期CTK合成相关基因(Os IPT9)平均表达量高于ESR品种,CTK降解相关基因(Os CKX11)平均表达量低于ESR品种。五个品种四个时期两个CTK合成相关基因(Os IPT8、Os IPT9)的平均表达量相对Os CKX11基因分别增加了4.04倍和5.03倍,表明Os IPT9基因在水稻叶片中表达丰度强于Os IPT8基因,说明在后期叶片衰老过程中Os IPT9基因编码的酶催化生成的CTK是影响后期水稻叶片衰老的主要原因。6.对不同水稻品种R期、RL期、L期、W期CTK信号转导通路相关基因表达量分析结果表明,随着发育进程的延伸,1923品种四个时期六个CTK信号转导(Os HK2、Os HK3、Os HP1、Os HP2、Os RR2、Os RR6)相关基因平均表达量均高于ESR品种,其中,五个品种四个时期三个基因(Os HK3、Os HP2、Os RR2)各自的平均表达量分别高于三个基因(Os HK2、Os HP1、Os RR6)各自的平均表达量;SGR品种三个基因(Os HK3、Os HP2、Os RR2)表达量均高于ESR。实验结果表明,五个品种信号通路相关基因整体表达水平显示在Os HK3-Os HP2-Os RR2通路高于其它信号基因参与的通路。且在该通路中SGR品种表达量高于ESR品种,与SGR品种后期叶片激素含量较高,ESR品种含量较低匹配。7.对不同水稻品种R期、RL期、L期、W期衰老相关转录因子(Osh69、Osh36)、衰老相关顺式作用元件(Os WRKY20、Os NAC92)、早衰基因(FDGOGAT)和持绿基因(Os Hox33)、衰老相关调节因子(Os GDCH)和细胞自噬相关基因(ATG13A)、衰老相关受体激酶基因基因(Os CLAVATA1、Os BAM1)、细胞分裂素介导叶绿体发育与衰老基因(Os GATA-Like、GATA17)分析结果表明,随着发育进程的延伸,SGR品种四个时期Osh36、Osh69、Os WRKY20、Os NAC92、Os Hox33、Os GDCH、ATG13A、Os CLAVATA1、Os BAM1、Os GATA-Like、GATA1平均表达量均高于ESR品种;1923品种四个时期FD-GOGAT平均表达量低于2314品种。SGR品种衰老上调基因(Osh69)平均表达量下降程度76%高于ESR品种38%。结果表明,类似FD-GOGAT这类早衰基因其表达量下降会延缓叶片衰老,而其他衰老相关基因对植物衰老的表达量是相对上调的,促进衰老上调基因下调则是相对下调的。8.对Os GDCH、FD-GOGAT、GATA17顺式作用元件预测分析,发现其启动子区域均存在较多与CTK、ABA、逆境(干旱)、糖以及叶肉细胞响应相关的顺式作用元件。说明可能参与CTK、ABA、逆境、糖的响应调控过程。通过对At BAM1、GDCH、FD-GOGAT、GATA17蛋白互作预测分析,发现均间接参与CTK调控Chl合成信号通路互作,推测这些基因可能在这条通路中扮演一定的角色。