梅花苯甲醇挥发相关基因PmABCG9的功能解析

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ABCG转运蛋白主要在金属离子、脂质、信号分子、次生代谢物和重金属等方面发挥转运功能。本研究针对梅花花香成分苯甲醇在不同开花时期的顶空挥发、内源含量和挥发效率进行梅花转录组测序,分析不同时期半分子转运基因WBC的表达量结果和q RT-PCR检测结果,筛选到与苯甲醇挥发相关的基因PmABCG9。根据梅花基因组中PmABCG9基因的序列,PCR扩增获得全长PmABCG9基因并构建p HZM27-ABCG9重组载体,将p HZM27-ABCG9表达载体转化到本氏烟草中,初步验证PmABCG9基因功能。本研究获得如下结果:1.对梅花‘彩枝舞粉’不同时期的花朵进行GC-MS检测,从梅花盛花的内源和挥发离子流图中发现都存在苯甲醇,对‘彩枝舞粉’花香成分苯甲醇挥发和内源进行定量分析。在大蕾期和初花期时苯甲醇的挥发量下降,内源含量略微增加。从挥发效率来看,苯甲醇在大蕾期和盛花期的挥发效率高,在初花期的挥发效率低,可知苯甲醇在初花期被大量转运生成乙酸苯甲酯。2.梅花转录组数据库ABCG亚家族基因中找到WBC型基因,其中有24条定位在膜上的半分子WBC型基因。根据不同部位WBC基因的表达量情况筛选出在花中表达量高的基因有8条。由梅花不同时期表达量数据可知,8条WBC候选基因中只有PmABCG9基因在大蕾中高表达,并用q RT-PCR对PmABCG9在不同时期的表达情况进行检验。结合苯甲醇在大蕾期的挥发效率较高,推测PmABCG9基因的高表达与花香成分苯甲醇挥发存在一定关系。3.从梅花‘彩枝舞粉’中克隆获得PmABCG9基因,全长1821 bp,编码606个氨基酸,没有内含子。生物信息学分析预测到PmABCG9蛋白有6个跨膜结构,半衰期30 h为不稳定蛋白。亚细胞定位预测到PmABCG9蛋白定位在质膜上,氨基酸分子量为67771.24 D,亲水指数(GRAVY)为0.264,PmABCG9有1个NBD核苷酸结构域和1个TMD跨膜结构域。PmABCG9蛋白的二级结构中α-螺旋占47.03%,延伸链14.69%。系统发育分析表明PmABCG9蛋白与扁桃Pd ABCG10蛋白、桃Pp ABCG10蛋白、东京樱花Py ABCG10蛋白和月季Rc ABCG10蛋白的亲缘关系较近,保守结构域预测均具有1个NBD和1个TMD结构域,属于WBC转运蛋白。4.成功构建p HZM27-ABCG9重组表达载体,转化野生型本氏烟草,PCR鉴定获得转ABCG9基因阳性苗并编号为ZYJ-24、27,观察转基因植株及其子一代植株表型发现基因PmABCG9的高表达对转基因烟草的表型没有影响,GC-MS检测转基因与野生型烟草叶片的挥发和内源中均未发现梅花花香挥发物苯甲醇。通过在转基因烟草叶片中孵育底物苯甲醇的方法,验证PmABCG9基因对苯甲醇的转运功能。结果发现转基因叶片在底物苯甲醇孵育体系中,与野生型烟草相比转基因叶片中苯甲醇的内源含量均明显降低。转基因烟草叶片中苯甲醇的挥发量均高于野生型,其内源含量则低于野生型,从顶空挥发与内源的关系看,转PmABCG9基因烟草中苯甲醇挥发效率远远大于野生型烟草,说明梅花PmABCG9转运蛋白能够有效转运苯甲醇。
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