神经元凋亡是由一系列基因控制的主动过程，转录抑制剂actinomycin D及蛋白合成抑制剂cycloheximide可以有效地保护神经元，说明凋亡的发生需要新的RNA的转录以及蛋白质的合成。从关键的信号转导通路入手，系统地寻找凋亡过程中的关键分子，并探索其调控机制对于认识凋亡发生的本质，以及干预凋亡的发生具有重要意义。 大量研究表明，JNK/c-Jun通路的激活在神经元凋亡过程中发挥了重要作用。比如在撤钾处理小脑颗粒神经元、撤NGF处理的交感神经元、β淀粉样蛋白处理大脑皮质神经元或MPP<'+>/MPTP诱导黑质神经元凋亡模型中，都已证明JNK被激活；激活的JNK通过磷酸化其下游底物转录因子c-Jun，促进靶基因的表达，从而诱发凋亡。研究发现：阻断JNK/c-Jun通路上的任何一点，如抑制JNK或其上游激酶MLKs，或用直接抑制c-Jun转录活性均能有效的干预凋亡的发生。说明JNK/c-Jun通路的活性为神经元凋亡所必需。 体外培养的高纯度(>95﹪)小脑颗粒神经元(cerebelar granule neuron，CGN)是神经元凋亡及其信号转导机制研究最经典、最常用的细胞模型之一。体内神经元存活有赖于“电活性”或神经营养因子的“营养”作用；体外原代培养的神经元如CGN的存活也必须得到类似的“营养”作用，如用高浓度KC1模拟体内“电活性”。当培养在高浓度KC1(25 mM KC1，25 K)(简称为25 K处理或25 K)培养基的CGN分化成熟时，将培养基中的高浓度KC1换成低浓度KCl(5 mM KC1)(简称为5 K处理或5 K)，CGN即发生典型的凋亡。在这一模型中，JNK/c-Jun通路激活并发挥了必不可少的促凋亡作用。JNK上游激酶MLKs抑制剂CEP11004，或JNK抑制剂SP600125可以有效地抑制凋亡的发生。更为重要的是，用多种方法直接阻断c-Jun的转录活性，如突变小鼠的c-Jun基因使其失去活性，显微注射特异性c-Jun抗体干扰其功能，或采用去除转录激活区保留DNA结合区的负显性c-Jun突变体阻断c-Jun的转录活性，均有效地干预了神经元凋亡的发生。说明c-Jun触发靶基因的表达对神经元凋亡是必须的。然而，作为转录因子，c-Jun究竟通过触发哪些靶基因的表达而实现其促神经元凋亡作用目前并不清楚。已有报道显示FasL是c-Jun促凋亡的靶基因，但后续的研究表明突变小鼠的FasL基因使其失去活性，并不影响神经元的凋亡。BH3-only蛋白家族的成员Bim(Bcl-2 interacting mediator of cell death，Bim)也被报道是c-Jun的促凋亡靶基因。但我们前期研究结果证明，从不同的水平阻断JNK-c-Jun通路，并不能抑制凋亡时Bim的诱导表达，说明JNK/c-Jun并没有参与Bim在神经元凋亡时表达上调。因此c-Jun的促凋亡靶基因目前仍不清楚。 c-Jun不仅仅具有促神经元凋亡的作用，它还参与细胞的增殖、存活、神经元轴突的再生等一系列生物学活动。在一些情况下，如5 K处理CGN、撤NGF处理交感神经元、淀粉样蛋白处理大脑皮质神经元、MPP<'+>/MPTP诱导黑质神经元凋亡时，JNK/c-Jun被激活且对凋亡的发生是必不可少的；在另一些情况下，如在背根节感觉神经元轴突再生等，JNK/c-Jun具有抗神经元凋亡作用。目前，对这一现象的解释大多停留在“神经元种类、发育阶段或模型不同”这一水平，其分子机制仍不清楚。c-Jun属于碱性-亮氨酸拉链(basic leucine zipper,bZip)蛋白成员，与其它bZip转录因子如c-fos家族(c-fos， fral，fra2等)和ATF家族(ATF2，ATF3等)成员形成异二聚体如c-Jun/c-fos或c-Jun/ATF2才能与DNA结合，促进靶基因的表达。因此，搭档(partner)的不同决定了c-Jun异二聚体与靶序列结合的特异性，选择性激活不同靶基因的表达，从而触发不同的生物学过程。 为了从源头寻找c-Jun的促凋亡靶基因并探索c-Jun促神经元凋亡的分子机制，本课题主要进行以下两个方面的研究： 1、用基因芯片的方法寻找和筛选c-Jun促凋亡靶基因。 2、研究c-Jun促神经元凋亡的分子机制。 结果： 1、抑制JNK/c-Jun对小脑颗粒神经元凋亡具有保护性干预作用为检测JNK/c-Jun通路的激活，我们将体外培养7天的小脑颗粒神经元，分别用25 K或5 K培养基处理0.5、1、2、4小时。收集蛋白后用磷酸化特异的JNK抗体检测JNK是否激活。观察到撤钾处理0.5小时后JNK磷酸化水平就开始上调，并在后续的检测时间点持续增加，说明JNK通路激活，同一张膜上检测到不同处理组JNK的总蛋白量保持一致，说明JNK磷酸化信号的增加不是蛋白上样量的差异造成的。c-Jun是JNK下游底物，活化后的JNK磷酸化c-Jun的63和73位丝氨酸，增强其转录活性。为进一步检测JNK活性，我们用c-Jun磷酸化抗体(Ser73)检测c-Jun磷酸化水平的变化，发现c-Jun磷酸化水平在撤钾0.5小时后显著增加，与JNK磷酸化变化趋势基本一致。 2、Dp5/hrk，puma，caspase-3,atf3和fn14是c-Jun的候选促凋亡靶基因为了从源头寻找c-Jun的靶基因，我们进行了以下研究：1.基因芯片技术：以25 K为对照，寻找5 K诱导的差异变化基因(25 K vs 5 K)并确定其中哪些能被Ad-△169抑制(5 K vs 5 K+△169)；2.重点选择能被.Ad-△169抑制且与凋亡发生密切相关的基因进行RT-PCR检测，证实基因芯片的结果。 3、c-Jun靶基因启动子都存在ATF位点c-Jun做为转录因子，需要和其他b-ZIP转录因子形成二聚体才能结合DNA发挥转录激活作用。不同的c-Jun二聚体对靶序列的选择性不同，与c-fos家族成员形成的二聚体如c-Jun/c-fos主要结合经典的7 bp的AP1序列，而与ATF家族成员形成的二聚体如c-Jun/ATF2选择性与8 bp的ATF/CRE序列结合。因此，通过与不同的转录因子形成二聚体c-Jun可以选择性触发靶基因的表达，而明确在神经元凋亡过程中c-Jun二聚体的组成对确立和进一步寻找c-Jun促凋亡靶基因具有非常重要的指导性意义。 4、神经元凋亡时c-Jun与ATF2形成二聚体为证实这一点，我们首先观察ATF家族蛋白是否激活。已有报道ATF2在CGN 5 K凋亡中激活，我们首先检测了ATF2的磷酸化水平变化。体外培养七天的神经元，分别给予25 K、5 K处理0.5、1、2、4小时。收集蛋白后进行WesternBlot方法分析。检测结果显示，ATF2磷酸化水平增加，说明其转录活性提高。我们也对c-fos的表达进行了研究。结果显示在凋亡的极早期(1小时)c-fos的mRNA和蛋白质水平即发生显著降低，并在以后各检测时间点继续降低。说明神经元凋亡时c-fos基因表达是下调的。这一结果提示我们在神经元凋亡过程中c-Jun可能与ATF2而不是c-fos形成复合物，激活下游的促凋亡靶基因。 5、神经元凋亡时ATF活性而不是AP1活性升高进一步我们用报道基因的方法进行观察与c-Jun结合的ATF位点和AP1位点在凋亡时活性的改变。5×ATF-1uc报道基因启动子区域含有5个串联的ATF位点，当转录激活的c-Jun/ATF2二聚体与之结合后可触发其下游荧光素酶的表达，与之类似，7×AP1-1uc报道基因启动子区域含有7个串联的AP1位点，用于反映c-Jun/c-fos的转录活性。体外培养第6天的神经元转染等量的7×AP1-1uc或5×ATF-1uc质粒，pCM-V-RL做为内参质粒12小时，然后25 K、5 K处理8小时，收集细胞并测定报道基因活性。结果显示，5×ATF-1uc在5 K处理时，活性增加4倍左右，说明与ATF位点结合的转录因子复合物活性增高。与此相反，7×AP1-1uc在25 K处理时活性很低，凋亡处理时没有变化。表明，在低钾诱导的神经元凋亡时，ATF位点被激活，AP1位点无反应性。 6、干预c-Jun/ATF2二聚体形成保护神经元为证明c-Jun/ATF2二聚体在神经元凋亡中的作用，我们通过RNA干扰技术抑制c-Jun或ATF2的表达，干扰c-Jun/ATF2复合物的形成，观察对低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡的作用。体外培养第5天的小脑颗粒神经元，用钙磷沉淀法转染shc.Jull-a，shc-Jun-b或空质粒BS/U6，同时共转染pEGFP质粒用于标记转染成功的细胞。48小时后，换成25 K、5 K模型。12小时后Hoechst 33258染色显示凋亡细胞，GFP阳性细胞数计为总数，计算凋亡率。结果显示干扰c-Jun表达后神经元凋亡率大大下降，同样，干扰ATF2也具有保护性干预作用。说明c-Jun/ATF2二聚体对神经元凋亡是必不可少的。 结论： 1、JNK/c-Jun是低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡所必需的； 2、Dp5/hrk，puma，caspase-3，atf3和m14是c-Jun的候选靶基因； 3、c-Jun和ATF2形成二聚体并介导了神经元凋亡。