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目的本实验室前期的实验研究表明在幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）感染的条件下,AGS细胞中ASH2L表达水平增高,且ASH2L和IQGAP1存在互作关系。本研究拟通过沉默ASH2L和IQGAP1基因以探索其对人胃癌AGS细胞的增殖、迁移、侵袭以及凋亡等生物学效应的影响并分析二者在Hp感染相关疾病中的作用机制。方法1.沉默ASH2L和IQGAP1基因对胃腺癌AGS细胞生物学效应的影响:用si RNA技术沉默胃腺癌AGS细胞中ASH2L基因、IQGAP1基因的表达,利用实时荧光定量PCR和Western blot检测沉默效果;用cck-8检测胃癌细胞的增殖情况;划痕愈合实验和transwell实验检测胃癌细胞迁移和侵袭能力的变化;TUNEL实验和流式细胞术检测胃癌细胞凋亡的情况。2.转录组测序（RNA-sequencing,RNA-seq）技术研究沉默ASH2L和IQGAP1基因与Hp感染在胃癌发生发展中的作用和机制:分别下调胃腺癌细胞AGS和正常胃粘膜上皮细胞GES-1中的ASH2L基因、IQGAP1基因的表达后,加入Hp感染因素处理,分别制备Hp感染和Hp未感染的AGS和GES-1细胞的三个生物学重复RNA样品,利用RNA-seq技术对转录组进行高通量测序,对测序数据进行生物信息学分析,将差异基因进行相应的富集分析（GO、KEGG）,再应用在线软件进行蛋白质的互作（Protein-Protein Interaction,PPI）网络分析,以探讨ASH2L与IQGAP1对细胞生物学效应影响的机制,分析Hp感染诱导与胃癌发生的可能机制以及ASH2L基因和IQGAP1基因在Hp感染激活的NF-κB信号通路中的作用和机制。结果1.沉默ASH2L和IQGAP1基因对AGS细胞生物学效应的影响结果（1）与对照组比较,ASH2L沉默组的ASH2L基因以及IQGAP1沉默组IQGAP1基因m RNA水平以及蛋白表达明显下调（P值均小于0.05）。（2）在分别沉默ASH2L和IQGAP1基因后,与对照组比较,AGS细胞增殖能力减弱、迁移能力减弱、侵袭能力减弱、凋亡率升高（P值均小于0.05）。2.转录组测序数据分析结果（1）ASH2L和IQGAP1基因在各组细胞中的沉默效率均高于75%,送检的30个RNA样本均符合测序标准。所有组别均富集到相关差异基因,差异基因的表达差异倍数|log2Fold Change|>1。（2）沉默ASH2L基因和沉默IQGAP1基因对胃腺癌AGS细胞生物学效应作用机制的分析:分析在AGS细胞中沉默ASH2L基因和沉默IQGAP1基因的转录组测序数据,利用韦恩分析,发现沉默两个基因后共同影响到的差异表达基因有829个,其中共同上调差异基因有160个,共同下调656个。进一步利用GO富集分析发现,共同作用于上皮细胞迁移的调节相关基因有ANXA3、HBEGF、ITGA3、ETS1、SCARB1、VEGFA、KLF4、ADGRA2、BCAS3、TDGF1、PTPRM、ACVRL1、ANGPT4、HRG;共同作用于内质网应激下的内源性凋亡信号通路的相关基因有CHAC1、CASP4、ATF4、XBP1、ERN1、TRIB3、PMAIP1。KEGG富集结果显示,沉默两个基因后引起的差异表达基因共同参与的生物学作用相关的信号通路有:m TOR signaling pathway、Apoptosis、Calcium signaling pathway、MAPK signaling pathway、TGF-beta signaling pathway、VEGF signaling pathway。（3）Hp感染对正常胃粘膜上皮细胞GES-1癌变作用机制的分析:分析Hp感染和Hp未感染GES-1细胞的差异表达基因库,同时分析AGS细胞与GES-1细胞中的差异表达基因库,进一步利用韦恩分析,发现两个差异基因库中共同的差异表达基因有1059个,其中共同上调差异基因有160个,共同下调656个。KEGG富集到与癌症发生相关的共同信号通路包括Pathways in cancer、Erb B signaling pathway、p53 signaling pathway、TGF-beta signaling pathway、MAPK signaling pathway、Wnt signaling pathway。（4）ASH2L基因和IQGAP1基因在Hp感染激活的NF-κB信号通路中的作用和机制的分析:在AGS细胞中沉默AHS2L基因,发现ASH2L与ALPK1基因的表达均显著下调,而在加入Hp感染后,ASH2L与ALPK1基因的表达下调不再显著;在AGS细胞中沉默IQGAP1基因,IQGAP1与ALPK1基因的表达均显著下调,在加入Hp感染后,IQGAP1基因的表达下调不再显著,而ALPK1基因有表达上调的趋势。由此推测Hp感染可能通过影响ASH2L基因和IQGAP1基因的表达量,以调节ALPK1基因的活性进而激活NF-κB信号通路,从而影响Hp感染后相关疾病的进展。结论在AGS细胞中实现了ASH2L和IQGAP1基因的沉默,ASH2L基因以及IQGAP1基因的沉默可以抑制AGS细胞增殖、迁移和侵袭,并促进其凋亡;ASH2L和IQGAP1可能通过VEGF signaling pathway通路调节细胞的迁移和侵袭、通过MAPK signaling pathway信号通路调节细胞凋亡;Hp感染可能通过Pathways in cancer、Erb B signaling pathway、p53 signaling pathway、TGF-beta signaling pathway、MAPK signaling pathway、Wnt signaling pathway信号通路导致正常胃粘膜上皮细胞发生癌变;Hp感染可能通过影响ASH2L、IQGAP1基因的表达,以调节ALPK1的活性,进而激活NF-κB信号通路来影响Hp感染相关疾病的发生与发展。