【摘 要】
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植物在生长发育过程中会遭受各种胁迫,包括生物胁迫(如病害、虫害等)和非生物胁迫(如盐碱、干旱、高温、冷害等)。为了完成生命周期,植物进化出了复杂的防御机制有效抵御外界环境胁迫。研究植物胁迫响应机制,挖掘抗逆基因,对培育抗逆农作物品种、减少农药使用造成的环境污染具有重要意义。囊泡运输介导了细胞内膜结构之间的物质运输和信号转导,参与了植物多种生物学过程,譬如植物生长发育和逆境响应。其中,胞吐(exoc
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植物在生长发育过程中会遭受各种胁迫,包括生物胁迫(如病害、虫害等)和非生物胁迫(如盐碱、干旱、高温、冷害等)。为了完成生命周期,植物进化出了复杂的防御机制有效抵御外界环境胁迫。研究植物胁迫响应机制,挖掘抗逆基因,对培育抗逆农作物品种、减少农药使用造成的环境污染具有重要意义。囊泡运输介导了细胞内膜结构之间的物质运输和信号转导,参与了植物多种生物学过程,譬如植物生长发育和逆境响应。其中,胞吐(exocytosis)是高尔基后运输囊泡与质膜的融合过程,介导了胞内物质分泌到细胞外和膜蛋白向质膜的转运。研究发现,胞泌复合体(exocyst)调控运输囊泡拴系到目的膜,是极性胞吐控制的关键机制。该复合体由8个蛋白亚基构成,其中EXO70是组成复合体功能的关键亚基。陆生植物EXO70编码基因在进化中发生大量扩增,其生物学意义不明,推测不同EXO70参与了包括胁迫响应等不同生物学过程。拟南芥基因组编码23个EXO70,目前关于其参与胁迫响应的报道非常有限,仅发现EXO70B1、EXO70B2和EXO70H1参与了抗病或抗旱响应。本研究以拟南芥EXO70家族为研究对象,分别从生物胁迫和非生物胁迫两个方面,运用反向遗传学、分子生物学和细胞生物学等多种手段,系统分析拟南芥23个EXO70成员在胁迫响应方面的表现,回答:1、除了已报道的成员外,还有哪些EXO70家族成员参与生物胁迫响应?2、哪些EXO70参与非生物胁迫响应?3、并对其胁迫响应机制进行初步探究。本论文主要研究结果如下:1.首先对EXO70家族的进化关系进行分析,发现整个家族同源性较高;同时对该家族基因T-DNA插入突变体进行了基因型鉴定,获得了23个基因的纯合突变体,用于后续表型分析。2.搜集公开的基因表达芯片数据,对EXO70家族进行热图分析,数据显示该家族EXO70B亚家族、EXO70D亚家族、EXO70E亚家族以及EXO70H亚家族部分基因等对生物胁迫和非生物胁迫均有响应。3.利用半定量PCR分析了EXO70家族基因对不同胁迫处理的响应,结果显示SA处理导致EXO70A亚家族、EXO70E2、EXO70F1、EXO70G1和EXO70H7等基因表达上调;EXO70B亚家族、EXO70D亚家族和EXO70G2基因表达下调;盐胁迫和干旱胁迫导致EXO70B亚家族、EXO70D亚家族、EXO70E亚家族基因、EXO70F1、EXO70G1以及EXO70H7等基因表达上调,表明这些基因参与了不同胁迫应答。4.利用黄萎病菌(Verticillium dahliae JR2)孢子悬液灌根接种法,对23个拟南芥EXO70的纯合突变体进行了抗性鉴定,发现exo70b1-2、exo70e2、exo70h2-2和exo70h7-1植株对黄萎病菌更敏感;利用灰霉病菌(Botrytis cinerea)孢子悬液叶片接种法对突变体进行病斑直径测量和台盼蓝染色,结果发现EXO70B1-1、EXO70H1、EXO70H2-2、EXO70H3-2以及EXO70H7-3突变导致植株对灰霉菌更易感。利用实时荧光定量PCR对接种灰霉菌的植株进行了抗性基因的检测,发现与野生型相比exo70b1-2中PR1和SID2表达量明显上调,表明EXO70B1通过PR1和SA途径参与灰霉菌抗病响应。5.为了进一步研究EXO70B1和EXO70H7的功能,构建了Pro EXO70B1::EXO70B1::GFP和35S::EXO70H7::GFP转基因植株,并对目的蛋白进行了初步的细胞学观察,发现EXO70B1在细胞质和质膜都有信号,而EXO70H7蛋白广泛分布在质膜、细胞质和细胞核中,表示其功能与胞内和质膜之间的物质运输有关。6.分析了EXO70家族23个成员基因敲除突变体对非生物胁迫的响应,发现与野生型相比,exo70h4和exo70f1主根生长对NaCl和ABA处理更敏感,说明EXO70H4和EXO70F1可能通过ABA途径参与植物对盐胁迫的应答。综上所述,拟南芥不同EXO70基因参与了不同逆境胁迫的响应,研究结果有助于理解EXO70家族基因扩增的生物学意义,为研究EXO70参与胁迫响应的机理奠定了工作基础。
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