血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme, ACE, EC 3.4.15.1)是一种通过肾素—血管紧张素系统(RAS)和激肽释放酶—激肽系统(KKS),对血压调节、电解质和体液平衡、心血管系统发育和结构重塑起重要作用的锌离子蛋白水解酶,广泛存在于脊椎动物体内。研究证实,ACE参与血管紧张素(AngⅡ)的生成和缓激肽(BK)的失活,其中ACE-C结构域是使血管紧张素Ⅰ (Ang Ⅰ)分解为AngⅡ的主要活性位点,而N结构域主要参与对缓激肽的水解。目前,用于ACEI药物筛选的酶靶均属全长ACE,如Captopril、Enalapril、Benazepril、 Fosinopril等。虽然这些药物均已成为治疗高血压的一线药物应用于临床,但都同时抑制了ACE的两个结构域蛋白。这种相对非选择性的ACEI在抑制AngⅡ生成的同时也抑制了缓激肽的降解,从而产生了咳嗽、肾功能不全等副作用。在已获得高纯度,高活性ACE-C结构域蛋白的前提下,本实验室首次利用分子克隆技术在毕赤酵母中表达了ACE-N结构域蛋白,为设计特异性ACEI类药物提供基础。本文利用NCBI搜索到人源ACE基因,选择N端长为1071bp的保守序列作为目的片段。通过RT-PCR方法从TE-1细胞中反转出cDNA,用PCR扩增得到ACE-N基因片段,构建出pPIC9K-ACE-N表达载体,然后转化毕赤酵母GS115,阳性克隆再次电转后用G418筛选高拷贝的酵母菌落进行表达。经Ni2’亲和层析柱对表达的蛋白进行纯化,获得的目的蛋白表达量为0.11g/L,其纯度大于99%。以HHL(N-Hippuryl-His-Leu)为底物,测得ACE, ACE-N和ACE-C的酶活力分别为21.22 U/mg,1.03 U/mg,118.64 U/mg,米氏常数Km分别为1.14mM,0.92mM,1.2mM。比较其Vmax, Kcat和Kcat/Km, ACE-C远远高于ACE和ACE-N,且ACE高于ACE-N。说明ACE-C对HHL的催化效率最高,ACE次之,ACE-N最低。本研究首次在毕赤酵母中表达了人源ACE-N结构域蛋白,为ACE-N结构域蛋白的体外活性实验提供了物质基础,也为建立血管紧张素转化酶C-结构域和N-结构域的特异性抑制剂的筛选模式奠定了基础。