无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）,革兰氏阳性菌,可以感染人类和多种脊椎动物,也是罗非鱼最主要的细菌性病原。近年来,我国罗非鱼无乳链球菌病害问题十分突出,严重威胁到罗非鱼水产品的安全以及养殖业的健康发展,而疫苗免疫将为该病的防治提供新的思路和手段,然而罗非鱼无乳链球菌的抗原成分不清制约着罗非鱼无乳链球菌病新型疫苗的开发。筛选无乳链球菌免疫原性蛋白,对于罗非鱼无乳链球菌病疫苗的开发,以及该病原的检测诊断都具有重要意义。本研究使用免疫蛋白质组学技术筛选、鉴定罗非鱼源无乳链球菌HN016株免疫原性蛋白,制备重组蛋白后免疫罗非鱼,并进行免疫效果评估,旨在为罗非鱼无乳链球菌病亚单位疫苗的研发提供候选材料和理论依据。本研究成功提取无乳链球菌HN016株胞壁蛋白并制备罗非鱼感染血清,通过免疫沉淀法,富集并筛选出具有免疫原性且高可信度的9个目的蛋白用作后续候选抗原的研究,成功构建9个重组质粒,并顺利诱导表达和纯化出6个重组蛋白（r Gap、r NADP-gly3、r PMCA-type、r ATP-Clp、r BMP-family、r Fts H）。将上述6个重组蛋白免疫罗非鱼后再攻毒,发现在中浓度（1×10~7 cfu/尾）攻毒剂量下,相对免疫保护率分别可达到:86.7%、93.3%、60.0%、66.7%、60.0%、73.3%;在低浓度（1×10~6 cfu/尾）攻毒剂量下,相对免疫保护率分别可达到:90.9%、72.7%、90.9%、63.6%、81.8%、72.7%。同时,通过血清抗体ELISA、组织载菌量、组织病理切片观察、荧光定量PCR等实验对上述重组蛋白的免疫保护效果进行评估。血清抗体效价检测结果显示:上述6个重组蛋白均可诱导罗非鱼产生高滴度的抗体水平。组织载菌量检测结果显示:在攻毒后,6个重组蛋白免疫组罗非鱼的脾脏、肝脏、头肾、体肾、脑和尾静脉全血中的载菌量相较于未经免疫的罗非鱼均有极显著的下降。选取免疫保护率较高、可产生抗体水平较高、且同时对病原菌的清除能力较好的r Gap和r NADP-gly3免疫组进行组织病理学观察,与未经过免疫保护实验组相比,r Gap和r NADP-gly3免疫组在脾脏、肝脏、头肾、体肾、脑组织和肠组织中的病理变化均显著减轻。最后通过荧光定量PCR实验,探究无乳链球菌攻毒后不同试验组免疫相关基因的表达变化,发现r Gap和r NADP-gly3免疫组罗非鱼天然免疫促炎细胞因子的表达显著被抑制,抑炎因子的表达升高;而获得性免疫系统CD4、CD8以及Ig T等分子表达量表现出不同程度上升。综上,本研究成功筛选到6个无乳链球菌保护性抗原,能对罗非鱼提供针对无乳链球菌感染的免疫保护效果。本研究结果将为后续罗非鱼亚单位疫苗等的研发提供重要科学依据,同时这些新鉴定的免疫原性蛋白对于新型诊断试剂的研究也具有重要意义。