【摘 要】
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9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮（9α-OH-AD）作为一种重要的甾体药物中间体,被广泛应用于合成氢化可的松等甾体激素类药物,具有良好的研究前景。目前利用微生物选择性地降解植物甾醇生成9α-OH-AD的过程存在转化周期长、转化效率低等问题,本论文突破传统的代谢途径改造的研究思路,将提高转化效率的现实生产问题聚焦于菌株的辅因子代谢与调控上,本论文以9α-OH-AD、AD（D）生产菌株为研究对象
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9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮（9α-OH-AD）作为一种重要的甾体药物中间体,被广泛应用于合成氢化可的松等甾体激素类药物,具有良好的研究前景。目前利用微生物选择性地降解植物甾醇生成9α-OH-AD的过程存在转化周期长、转化效率低等问题,本论文突破传统的代谢途径改造的研究思路,将提高转化效率的现实生产问题聚焦于菌株的辅因子代谢与调控上,本论文以9α-OH-AD、AD（D）生产菌株为研究对象,综合辅因子工程,基因工程和介质工程技术,构建了辅因子依赖的9α-OH-AD高效生产菌株,并优化转化工艺,为9α-OH-AD的工业化生产提供了理论基础和技术支持。根据前期实验基础发现,菌体在代谢植物甾醇时存在辅酶Ⅰ不平衡问题,本文以能够利用NADH生成NAD+进而调节菌体内NAD+/NADH水平的植物甾醇降解关键酶为研究对象,包括NADH依赖的侧链降解初始酶C27位单加氧酶（Cyp125）和催化AD生成9α-OH-AD的关键酶9α羟化酶（Ksh）,以实验室现有9α-OH-AD生成菌株偶发分枝杆菌（MFT）为宿主细胞,同时结合课题组前期发现的异源过表达菌株的生产效果较好的现象,将敲除3-甾酮-Δ~1-脱氢酶（ksdd）的新金分枝杆菌（QCM3）中的Ksh、Cyp125与穿梭质粒pMV261连接并克隆至宿主细胞MFT中,成功构建了重组工程菌株MFT/pMV261-KSHA1BQCM3、MFT/pMV261-KSH2BQCM3、MFT/pMV261-CYP125-1QCM3、MFT/pMV261-CYP125-2QCM3、MFT/pMV261-CYP125-3QCM3。同时为了多线路获得9α-OH-AD的高效生产菌株,将MFT中的Ksh异源转入到QCM3中,构建了工程菌株QCM3/pMV261-KSHA1MFT、QCM3/pMV261-KSHA2MFT、QCM3/pMV261-KSHA3MFT、QCM3/pMV261-KSHA4MFT、QCM3/pMV261-KSHA5MFT、QCM3/pMV261-KSHB1MFT、QCM3/pMV261-KSHB2MFT,对构建好的工程菌株进行转化实验,成功筛选出9α-OH-AD生产优良菌株QCM3/pMV261-KSHA4MFT,转化率达到80.78%,较工业用生产菌株MFT提高了10.2%。针对甾醇代谢过程中产生过量的丙酰辅酶A对菌体生长的抑制问题,将KSHA4MFT与丙酰辅酶A代谢全局调控因子Prp R进行串联表达,成功构建串联表达菌株QCM3/pMV261-KSHA4MFT-PRPRMFT。同时将KSHA4MFT与NADH依赖的NDH进行串联,成功构建了QCM3/pMV261-KSHA4MFT-NDHMFT。甾醇转化实验结果表明,在分枝杆菌中串联表达PRPR时9α-OH-AD转化率最高,达到85.7%。研究并建立了9α-OH-AD的高效转化工艺。基于介质工程和pH调控技术对最优菌株进行发酵工艺优化,当接菌量为8%、发酵介质为甲基-β-环糊精、用磷酸盐缓冲液调节发酵液p H为7.5、补糖浓度为5 g/L时转化率达到最高为96.65%,较优化前提升了10.95%。
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