结直肠癌发病率高居恶性肿瘤第三位,死亡率居第二位,是全球重大的公共卫生问题。结直肠癌早期往往没有明显症状,大多数病人以及宠物发现时已经到了癌症晚期。手术是原发性结直肠癌治疗的首选方式,具有效果明显、没有生物抵抗性等优点,但风险性较高,创伤较大。放疗和化疗常作为手术治疗的辅助疗法,但具有较高的毒副作用,对于身体素质较差、疾病累积严重以及转移和复发的群体通常作用不大。随着诊断水平的提高和靶向治疗技术的进步,人们越来越关注指示效果显著的结直肠癌分子靶标。目前,常见的肿瘤标志物包括蛋白质、DNA、RNA以及肠道微生物组成等,其中,一些受体具有良好的靶向治疗潜力。目前国内上市的结直肠癌靶向药物主要针对表皮生长因子受体和血管内皮生长因子。虽然这些药物在临床中具有良好的疗效和安全性,但靶标单一,只能使少量结直肠癌患者受益。已经上市的靶向药物有效率在15%-20%左右,临床实践中诊断标志物和治疗方案还远远不能满足日益增多的结直肠癌患者需求。胆囊收缩素Ⅱ型受体（Cholecystokinin type Ⅱ receptor,CCK2R）属于G蛋白偶联受体超家族成员,已报道在胰腺癌、胃癌、结直肠癌中高表达。胃泌素和胆囊收缩素（Cholecystokinin,CCK）是CCK2R的2种天然配体,它们共同协作实现生理功能,并在不同癌症中发挥不同作用。越来越多的证据支持胃泌素可通过与CCK2R结合在刺激癌细胞生长和侵袭过程中发挥作用。然而,CCK在CCK2R介导的结直肠癌发生和发展中的作用并不清楚。本研究旨在分析CCK2R及其配体在结直肠癌中的生物学功能,进而根据相关作用机制构建和优化靶向CCK2R重组毒素,探究该重组毒素的治疗潜力和体内安全性,为临床前研究和临床试验提供理论基础。首先,通过生物信息学、RT-q PCR方法以及免疫组化方法验证CCK2R在结直肠癌患者临床样本中的表达量。结果表明,与癌旁正常组织相比,CCK2R表达水平在结直肠癌组织中明显上调,其高表达指示患者更短的总生存期,是结直肠癌发展过程中独立的预后因子。然后,利用慢病毒包装和过表达技术构建结直肠癌CCK2R敲减和过表达细胞模型。通过体外毒性实验、克隆形成实验、细胞周期实验、伤口愈合实验、Transwell实验和裸鼠异种移植瘤实验进行分析,研究CCK2R对结直肠癌细胞特性的影响。结果表明,CCK2R过表达导致结直肠癌细胞增殖能力和克隆形成能力增强,细胞周期S期比例增加;相反,CCK2R敲减导致体内和体外结直肠癌细胞增殖能力减弱,细胞周期阻滞在G0/G1期。此外,CCK2R过表达增强结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力;相反,CCK2R敲减可以抑制大部分结直肠癌细胞的迁移和侵袭。以上结果表明,CCK2R对结直肠癌细胞的增殖和克隆形成过程起关键作用,对多数结直肠癌细胞的迁移和侵袭起重要作用。为探究CCK2R与其配体在结直肠癌发生以及发展过程中的功能和作用机制,使用酰胺化的胃泌素17（Gastrin 17,G-17）和八肽胆囊收缩素（Cholecystokinin 8,CCK-8）处理结直肠癌细胞模型,并通过细胞增殖检测试剂盒、Ed U实验和伤口愈合实验分析癌细胞的增殖和迁移变化。结果表明,G-17和CCK-8均可以与CCK2R结合。其中,G-17以CCK2R依赖的方式促进结直肠癌细胞增殖;相反,CCK-8以CCK2R依赖的方式抑制结直肠癌细胞增殖。CCK-8可以通过与自分泌的胃泌素竞争癌细胞表面CCK2R受体发挥作用。进一步,通过RNA-seq技术分析CCK/CCK2R轴抑制结直肠癌细胞的潜在分子机制。结果表明,CCK-8刺激与CCK2R敲减具有共有的下游分子表达模式,说明CCK与CCK2R功能联系密切。KEGG分析和Western blot验证表明,CCK-8添加抑制结直肠癌细胞MAPK信号,CCK/CCK2R轴可能通过抑制ERK和JNK MAPK信号通路发挥功能。基于上述实验结果,尝试将CCK/CCK2R轴应用于结直肠癌重组毒素。结果显示,CCK-8与PE毒素融合表达阻碍其与CCK2R结合;相反,反向CCK-8与PE毒素融合表达保留CCK-8与CCK2R的结合特性。为分析融合表达后反向CCK-8的活性,使用点突变技术失活PE38功能位点。结果表明,大肠杆菌系统表达的基于反向CCK-8的重组毒素保留了与CCK2R的结合能力,但降低了自身肿瘤抑制活性。为弥补这一损失,通过构建连接子库和随机突变对重组毒素的连接子和毒素单元进行优化。经筛选,获得产量高、稳定性好且细胞杀伤活性良好的靶向CCK2R重组毒素GD9P。该重组毒素在大肠杆菌表达系统中高效表达,经两步纯化后纯度为92.1%,与结直肠癌细胞表面CCK2R亲和力为78.3 n M。为进一步检测GD9P在小鼠体内的半衰期、药效以及安全性。通过双抗夹心ELISA方法检测GD9P的药代动力学特性,并在ICR小鼠中验证GD9P的急性毒性。结果表明,重组毒素GD9P具有良好的药代动力学参数,半衰期为69.315 min。急性毒性实验结果表明,该药物不引起胃肠道毒性及全身毒性。通过建立裸鼠异种移植模型并进行为期10天的治疗检验GD9P药物效果。结果显示,中剂量GD9P（4 mg/kg）可以阻止肿瘤进展,而高剂量GD9P（8 mg/kg）或联合用药几乎可以诱导肿瘤完全消失。标准程序治疗后各GD9P治疗组小鼠组织切片无明显异常,奥沙利铂治疗组出现一定程度的肝脏、肾脏和肺脏损伤。此外,GD9P与奥沙利铂联合用药可以减少化疗药物引起的毒副作用。以上结果表明,GD9P在小鼠体内的靶向治疗效果和安全性良好。通过以上研究,本课题证明了CCK2R在结直肠癌发生和发展中具有促进作用。CCK-8通过CCK2R发挥结直肠癌抑制功能,基于CCK-8的重组毒素具有良好的肿瘤杀伤活性和安全性,具体表现为:CCK2R在结直肠癌患者的癌组织和癌旁正常组织中差异表达,该受体对结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭过程起重要作用;酰胺化的G-17和CCK-8以CCK2R依赖的方式分别促进和抑制结直肠癌细胞增殖,其中,CCK-8通过竞争胃泌素和减弱MAPK信号抑制结直肠癌细胞增殖;经过优化和筛选,成功获得基于CCK-8的CCK2R高效靶向重组毒素GD9P;该药物在小鼠中具有良好的药代动力学特性、体内抗肿瘤活性和安全性。