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目的:探讨适于表面增强激光解析电离飞行时间质谱(SELDI- TOF-MS)分析乳腺癌细胞亚细胞蛋白的检测方案。比较体外培养乳腺癌细胞与正常乳腺细胞的线粒体、细胞核和细胞膜蛋白指纹图谱,筛选差异表达蛋白,为乳腺癌蛋白标志物的筛选提供依据。方法:1.用蛋白分子量标准品Insulin, Cyto C, Mb对SELDI-TOF MS进行分子量校正。2. PRMI1640培养乳腺癌细胞MCF-7,收集对数生长期细胞,提取亚细胞蛋白,丙酮沉淀后4‰Triton X-114溶解。3.选择不同激光强度,运用SELDI-TOF-MS对直接提取和预处理的亚细胞蛋白进行蛋白指纹图谱检测,建立SELDI-TOF-MS检测亚细胞蛋白的方案。4.提取-80℃冻存2个月以上细胞的亚细胞蛋白,丙酮沉淀后SELDI-TOF-MS检测亚细胞蛋白指纹图谱,与未冻存细胞亚细胞蛋白指纹图谱比较,探讨细胞冻存对亚细胞蛋白分析的影响。5.采用优化方案提取、沉淀、溶解和定量乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MCF-7及乳腺正常细胞株HBL-100的线粒体,细胞核和细胞膜蛋白,Olympus AU 2700生化分析仪检测各亚细胞蛋白含量。6.以相同量蛋白点样Au芯片,SELDI-TOF-MS检测乳腺癌与乳腺正常细胞亚细胞蛋白指纹图谱,运用Biomarker Wizard Software和Biomarker Patterns Software分析软件对结果进行统计分析,筛选各亚细胞组分差异表达蛋白。结果:1. 3种蛋白标准品对SELDI-TOF-MS的相对分子量进行校准,结果显示SELDI检测蛋白分子量的偏差<0.1%,表明其检测的准确性。2.提取亚细胞蛋白,丙酮沉淀后,4‰Triton X-114溶解效果好。3.不同激光强度下的蛋白指纹图谱差异较大,在激光强度为190时,蛋白峰多,蛋白丰度高,基线稳定。实验发现直接提取样品几乎不能通过SELDI检测,而亚细胞蛋白经过丙酮沉淀后再利用4‰Triton X-114溶解是SELDI-TOF-MS检测亚细胞蛋白比较理想的预处理方案。4.与新鲜细胞提取的细胞膜、细胞核和线粒体蛋白指纹图谱比较,-80℃冻存2月以上细胞提取的亚细胞蛋白在蛋白峰数目和蛋白丰度上均未显示明显的差异,提示长期冻存对亚细胞蛋白指纹图谱分析影响较小。5. AU 2700生化分析仪检测结果显示,HBL-100、MDA-MB-231和MCF-7线粒体蛋白浓度分别为82.23±21.70μg/ml, 78.76±26.45μg/ml, 85.07±19.39μg/ml;细胞核蛋白53.43±13.96μg/ml, 46.77±18.72μg/ml,58.67±20.02μg/ml;细胞膜蛋白95.47±30.64μg/ml, 84.56±17.06μg/ml,77.42±20.48μg/ml。6. Biomarker Patterns Software软件分析显示,与乳腺正常细胞株HBL-100相比,乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MCF-7各亚细胞蛋白组分存在明显差异。其中9.2kD、13.8kD、14.0kD和22.5kD的线粒体蛋白在两株癌细胞中表达均降低,分子量10.0kD和11.6kD的线粒体蛋白在两株癌细胞中表达均增高。5.7kD、8.3kD和18.2kD的细胞核蛋白在两株癌细胞中表达均降低,9.9kD和15.7kD的细胞核蛋白在两株癌细胞中表达均增高。7.8kD,8.4kD和8.8kD的细胞膜蛋白在两株癌细胞中表达均降低,9.6kD的细胞膜蛋白在两株癌细胞中表达均增高。结论:1.本实验成功建立了与质谱兼容的乳腺癌细胞膜蛋白、细胞核蛋白和线粒体蛋白的提取、沉淀和溶解方案。2.与乳腺正常细胞株HBL-100相比,乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MCF-7在线粒体、细胞核和细胞膜蛋白表达上存在明显差异。3.本实验从亚细胞蛋白水平筛选出了10多种乳腺癌细胞差异表达蛋白,为乳腺癌蛋白标志物的研究奠定了基础。