论文部分内容阅读
目的:检测肝癌组织和癌旁正常肝组织中,组织因子途径抑制物2(TFPI-2)基因表达的差异;转染TFPI-2基因真核表达载体(pcDNA3.1-TFPI-2)入人肝癌细胞株HepG2,筛选其稳定表达细胞株;探讨TFPI-2在肝癌细胞生长、侵袭和转移中的作用及机制。方法:第一阶段:以TFPI-2 cDNA为探针,应用原位杂交技术检测肝癌组织和癌旁正常肝组织中TFPI-2 mRNA表达的差异;应用免疫组化和Western Blot印迹方法,检测两种组织中TFPI-2蛋白表达的差异。第二阶段:利用脂质体将pcDNA3.1-TFPI-2真核表达载体转染人肝癌细胞株HepG2,G418筛选稳定表达的细胞系,RT-PCR检测转染前后TFPI-2 mRNA的表达,Western Blot检测转染前后培养液中TFPI-2蛋白的表达;第三阶段:应用MTT法测定转染pcDNA3.1-TFPI-2对HepG2细胞生长曲线的影响,并用流式细胞仪分析转染前后HepG2细胞增殖周期的改变;利用Transwell小室法检测转染前后肝癌细胞穿膜细胞数,评价肝癌细胞体外侵袭迁徙能力的变化。结果:与正常肝组织相比,肝癌组织中TFPI-2 mRNA的表达显著降低,TFPI-2阳性标记指数分别为30.66±2.47和88.23±1.43 (P < 0.05);免疫组化检测肝癌组织中TFPI-2蛋白的表达显著降低,TFPI-2阳性标记指数分别为22.54±1.22和46.60±1.80 (P < 0.05);Quantity One软件分析Western blot TFPI-2蛋白条带灰度值,与β-actin比值分别为1.14±0.13和0.89±0.15 ,差别有统计学意义(P < 0.05)。成功转染pcDNA3.1-TFPI-2的HepG2细胞,证实有TFPI-2 mRNA和蛋白的表达;与未转染的细胞相比,转染后的HepG2细胞生长明显受到抑制,细胞增殖周期阻滞于G0/G1期;转染TFPI-2的HepG2细胞体外侵袭能力显著下降(穿膜细胞数为45.2±5.6 vs 87.8±4.5, P < 0.05);迁徙能力无明显变化(穿膜细胞数为140.4±7.4 vs 152.8±9.6, P > 0.05)。结论:TFPI-2在人正常肝组织中有高丰度表达,而在肝癌组织中的表达显著降低;TFPI-2基因表达能够在体外抑制肝癌细胞增殖,降低其体外侵袭能力,为进一步研究肝癌的基因治疗提供了实验依据。