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3-羟基丙酸（3-hydroxypropionic acid，3-HP）是一种重要的平台C3化合物，利用微生物生产3-HP是目前研究的热点。本论文以高效利用甘油的肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）为宿主菌，采用分子生物学手段，从以下三个方面构建了3-HP的高产菌株，并对高产菌株生产3-HP进行了初步研究。1、本研究首次采用全局转录机器工程（gTME）的策略，利用易错PCR技术构建K.pneumoniae关键元件首要σ因子基因rpoD的突变文库，连接至表达载体pET-PK，电转化K.pneumoniae DSM2026，从大量阳性克隆中筛选出一株3-HP高产菌K.p(pET-PK-mrpoD)。初步发酵试验表明，该携带突变rpoD基因的重组菌能高效利用甘油生产3-HP，产量达到4.49g/L，比携带野生型rpoD基因的对照菌提高242.75%，甘油转化率、生产强度分别提高了832.50%、239.39%。2、本研究克隆了来自于大肠杆菌（Escherichia coli）的醛脱氢酶基因aldH，连接至表达载体pET-PK，电转化K.pneumoniae DSM2026，得到重组菌K.p(pET-PK-aldH)。试验表明，基因aldH成功表达，K.p(pET-PK-aldH)的3-HP产量达到2.96g/L，比对照菌K. p (pET-PK)提高了1.5倍，生产强度提高57.36%。3、本研究首次采用同源重组策略，设计了以基因aldH为核心的同源重组片段，利用K.pneumoniae自身的RecA同源重组系统，将同源重组片段转换到K.pneumoniae染色体的IS1位置，构建了重组菌KpAD。试验表明，转换至染色体上的基因aldH成功表达，KpAD/Kan~+的3-HP产量达到0.84g/L，KpAD/Kan-的3-HP产量达到了0.90g/L，分别是对照菌产量0.60g/L的1.4、1.5倍，KpAD/Kan-的甘油转化率、生产强度是对照菌的1.7、1.5倍，KpAD/Kan+的甘油转化率、生产强度是对照菌的2、1.4倍。