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研究背景及目的：
肺癌是世界上常见的恶性肿瘤之一。由于缺乏有效的早期诊断的方法，肺癌具有很高的死亡率。据报道，57%的肺癌患者都会自发转移，并且能够影响各个组织与器官。肺癌大体上可以分为两种亚型：一种是非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer ， NSCLC )，另一种是小细胞肺癌(small-cell lung cancer, SCLC)。非小细胞肺癌是肺癌最普遍的类型，占所有肺癌患者的比例为80%-85%，其发展相对缓慢，晚期患者会发生临近组织或器官转移。尽管过去的几年，针对NSCLC的治疗手段如手术、化疗、放疗及靶向治疗等在不断改进，但仍有许多NSCLC患者特别是晚期患者的治疗效果不佳。因此，我们需要研究出一些治疗NSCLC患者特别是晚期患者更加有效的治疗方法。
在过去的几年，肿瘤的免疫治疗逐步走入了我们的视野，2013年《Science》将其列为年度科学十大突破之首。而且免疫检查点程序性死亡受体1(P programmed cell death protein 1,PD-1 )及其配体(Programmed death ligand 1, PD-L1)阻断剂也被认为是未来治疗实体瘤非常有前景的治疗方法，目前已经被FDA批准应用于NSCLC患者的治疗。PD-1为CD28超家族成员，是一种重要的免疫抑制分子，当与其配体PD-L1结合后能够抑制效应T细胞的活化，导致效应性T细胞不能有效杀伤肿瘤细胞。调节性T细胞(Regulatory T cells，Tregs)，是NSCLC肿瘤微环境中主要的免疫抑制性细胞之一。一方面Tregs通过抑制CD8+细胞的激活，抑制针对肿瘤细胞的免疫反应；另一方面在体内，Tregs主要通过分泌多种细胞因子，如TGF-β、IL-10等，促进肿瘤细胞的进展。许多文献已经表明NSCLC细胞可以通过招募Tregs细胞，抑制机体对肿瘤的免疫作用，促进肿瘤的进展。之前大家普遍认为利用抗PD-1/PD-L1单抗治疗肿瘤主要是由于重新激活的效应性T细胞的抗肿瘤免疫，但随后的一些研究发现应用抗PD-L1单抗可以直接抑制肿瘤细胞的增殖并扰乱其代谢途径。目前，越来越多的PD-L1阻断剂抗肿瘤作用的机制被揭示，但NSCLC患者肿瘤组织中PD-L1的表达水平与肿瘤微环境抑制性细胞浸润程度之间的关系仍没有被揭示。我们希望通过进一步揭示NSCLC中PD-L1的表达与Tregs在肿瘤组织浸润的关系，进一步为NSCLCPD-L1阻断剂的应用提供理论依据
本研究利用临床标本分析了PD-L1与NSCLC患者临床参数之间的关系，并利用国际癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)和临床标本检测了NSCLC组织中PD-L1的表达水平与组织中Tregs含量的相关性；并进一步在体外实验进一步验证PD-L1对Tregs的招募作用并探讨了其机制。同时在动物模型中研究应用PD-L1阻断剂对Tregs在肿瘤组织中浸润的影响。
第一部分PD-L1在NSCLC患者中的表达及与临床参数的分析
1)采用qPCR的方法检测PD-L1在NSCLC癌与癌旁表达的差异。
2)采用qPCR检测PD-L1在不同分期NSCLC患者中表达的差异。
3)分析PD-L1mRNA表达水平与患者预后的相关性。
4)采用qPCR的方法检测肺永生化细胞系16HBE与肺癌细胞系A549PD-L1表达的差异。
结果
1)NSCLC患者癌中PD-L1mRNA表达水平明显高于癌旁。
2)晚期NSCLC患者癌中PD-L1mRNA表达水平明显高于早期NSCLC患者。
3)NSCLC患者PD-L1mRNA水平高表达组的患者生存时间低于低表达组
4)肺癌细胞系A549PD-L1mRNA的表达水平明显高于肺永生化细胞系16HBE。
小结
1)PD-L1与NSCLC患者肿瘤进展密切相关。
2)KHSRP的mRNA表达水平与患者生存期相关。
第二部分NSCLC患者癌中PD-L1的表达水平与Treg在癌中浸润程度及其机制的研究
1)利用TCGA数据及现有的临床标本分析NSCLC患者癌中PD-L1与FOXP3基因水平的相关性。
2)利用流式细胞仪分析新鲜NSCLC临床标本肿瘤细胞PD-L1的表达水平与组织中Treg比例的关系。
3)利用TCGA数据及现有临床标本分析NSCLC患者分析FOXP3mRNA水平在癌与癌旁及不同分期之间的差异。
4)分析NSCLC临床标本癌中FOXP3mRNA表达水平与患者预后的关系。
5)体外利用IFN-γ构建A549高表达PD-L1体系，分为NC、IFN-γ、IFN-γ+PD-L1阻断剂三组，利用细胞多因子筛选试剂盒检测差异趋化因子。
6)利用TCGA数据库及临床样本同时验证NSCLC组织中PD-L1的表达水平与差异趋化因子表达水平及差异趋化因子表达水平与FOXP3水平的相关性。
7)利用免疫组化方法检测临床标本中差异趋化因子与FOXP3的相关性。
8)体外通过细胞系的不同处理后(NC、IFN-γ、IFN-γ+anti-PD-L1、IFN-γ+si-PD-L1、PD-L1过表达、PD-L1过表达+anti-PD-L1)，检测差异趋化因子表达水平的变化。
9)通过网站预测PD-L1调节差异趋化因子表达的可能通路，并进行体外验证。
结果
1)TCGA及临床标本分析表明肿瘤组织中PD-L1mRNA水平与FOXP3呈正相关。
2)流式检测结果表明肿瘤组织中的PD-L1表达水平与Treg的比例呈正相关。
3)FOXP3在癌中的mRNA水平高于癌旁，晚期NSCLC患者高于早期患者。
4)FOXP3高表的患者的预后较低表患者差。
5)通过趋化因子筛试剂盒检测，我们发现CCL5的差异较大。
6)TCGA与临床标本同时检测发现PD-L1与CCL5，CCL5与FOXP3基因水平呈正相关。
7)免疫组化结果表明肿瘤组织中CCL5含量与FOXP3呈正相关。
8)通过检测发现INF-γ处理及PD-L1过表达后肿瘤细胞系表达的CCL5水平明显升高，而IFN-γ+anti-PD-L1、IFN-γ+si-PD-L1、PD-L1过表达+anti-PD-L1组CCL5表达水平都会显著下降。
9)PD-L1可以通过促进AKT/NF-κB磷酸化，促进CCL5的分泌。而且应用AKT和NF-κB抑制剂后，CCL5表达水平显著降低。
小结
1)通过TCGA数据库及临床标本结果表明PD-L1可能通过CCL5促进Treg向肿瘤组织趋化。
2)体外实验表明应用PD-L1阻断剂后可以抑制肿瘤细胞CCL5的分泌。
3)PD-L1通过活化AKT/NF-κB通路调节CCL5的分泌。
第三部分动物模型验证应用PD-L1阻断剂可以降低TregNSCLC组织中的浸润
方法
1)人肺癌细胞系在小鼠皮下成瘤，检测PD-L1对肿瘤生长体积的影响。
2)qPCR检测三组肿瘤组织中CCL5的表达水平。
3)利用免疫组化检测三组CCL5及FOXP3表达的差异。
4)流式检测三组中Treg所占比例及数目的差异。
结果
1)NC组及PD-L1过表达+anti-PD-L1处理组的肿瘤体积小于PD-L1过表达组。
2)NC组及PD-L1过表达+anti-PD-L1处理组的肿瘤组织中CCL5的mRNA表达水平低于PD-L1过表达组。
3)免疫组化结果显示NC组及、PD-L1过表达+anti-PD-L1处理组的肿瘤组织中CCL5及FOXP3的表达水平低于PD-L1过表达组。。
4)NC组及、PD-L1过表达+anti-PD-L1处理组的肿瘤组织中Treg的比例低于PD-L1过表达组。
小结
应用PD-L1阻断剂可以抑制Treg向肺癌组织浸润，降低肿瘤组织中Treg的比例，从而抑制肿瘤的进展。
结论
在NSCLC的肿瘤微环境中，肿瘤细胞表达的PD-L1可以通过AKT/NF-κB通路促进CCL5的分泌，导致Tregs向肿瘤组织趋化。而应用PD-L1阻断剂可以减弱Tregs向NSCLC组织趋化,进而抑制肿瘤的进展。
肺癌是世界上常见的恶性肿瘤之一。由于缺乏有效的早期诊断的方法，肺癌具有很高的死亡率。据报道，57%的肺癌患者都会自发转移，并且能够影响各个组织与器官。肺癌大体上可以分为两种亚型：一种是非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer ， NSCLC )，另一种是小细胞肺癌(small-cell lung cancer, SCLC)。非小细胞肺癌是肺癌最普遍的类型，占所有肺癌患者的比例为80%-85%，其发展相对缓慢，晚期患者会发生临近组织或器官转移。尽管过去的几年，针对NSCLC的治疗手段如手术、化疗、放疗及靶向治疗等在不断改进，但仍有许多NSCLC患者特别是晚期患者的治疗效果不佳。因此，我们需要研究出一些治疗NSCLC患者特别是晚期患者更加有效的治疗方法。
在过去的几年，肿瘤的免疫治疗逐步走入了我们的视野，2013年《Science》将其列为年度科学十大突破之首。而且免疫检查点程序性死亡受体1(P programmed cell death protein 1,PD-1 )及其配体(Programmed death ligand 1, PD-L1)阻断剂也被认为是未来治疗实体瘤非常有前景的治疗方法，目前已经被FDA批准应用于NSCLC患者的治疗。PD-1为CD28超家族成员，是一种重要的免疫抑制分子，当与其配体PD-L1结合后能够抑制效应T细胞的活化，导致效应性T细胞不能有效杀伤肿瘤细胞。调节性T细胞(Regulatory T cells，Tregs)，是NSCLC肿瘤微环境中主要的免疫抑制性细胞之一。一方面Tregs通过抑制CD8+细胞的激活，抑制针对肿瘤细胞的免疫反应；另一方面在体内，Tregs主要通过分泌多种细胞因子，如TGF-β、IL-10等，促进肿瘤细胞的进展。许多文献已经表明NSCLC细胞可以通过招募Tregs细胞，抑制机体对肿瘤的免疫作用，促进肿瘤的进展。之前大家普遍认为利用抗PD-1/PD-L1单抗治疗肿瘤主要是由于重新激活的效应性T细胞的抗肿瘤免疫，但随后的一些研究发现应用抗PD-L1单抗可以直接抑制肿瘤细胞的增殖并扰乱其代谢途径。目前，越来越多的PD-L1阻断剂抗肿瘤作用的机制被揭示，但NSCLC患者肿瘤组织中PD-L1的表达水平与肿瘤微环境抑制性细胞浸润程度之间的关系仍没有被揭示。我们希望通过进一步揭示NSCLC中PD-L1的表达与Tregs在肿瘤组织浸润的关系，进一步为NSCLCPD-L1阻断剂的应用提供理论依据
本研究利用临床标本分析了PD-L1与NSCLC患者临床参数之间的关系，并利用国际癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)和临床标本检测了NSCLC组织中PD-L1的表达水平与组织中Tregs含量的相关性；并进一步在体外实验进一步验证PD-L1对Tregs的招募作用并探讨了其机制。同时在动物模型中研究应用PD-L1阻断剂对Tregs在肿瘤组织中浸润的影响。
第一部分PD-L1在NSCLC患者中的表达及与临床参数的分析
1)采用qPCR的方法检测PD-L1在NSCLC癌与癌旁表达的差异。
2)采用qPCR检测PD-L1在不同分期NSCLC患者中表达的差异。
3)分析PD-L1mRNA表达水平与患者预后的相关性。
4)采用qPCR的方法检测肺永生化细胞系16HBE与肺癌细胞系A549PD-L1表达的差异。
结果
1)NSCLC患者癌中PD-L1mRNA表达水平明显高于癌旁。
2)晚期NSCLC患者癌中PD-L1mRNA表达水平明显高于早期NSCLC患者。
3)NSCLC患者PD-L1mRNA水平高表达组的患者生存时间低于低表达组
4)肺癌细胞系A549PD-L1mRNA的表达水平明显高于肺永生化细胞系16HBE。
小结
1)PD-L1与NSCLC患者肿瘤进展密切相关。
2)KHSRP的mRNA表达水平与患者生存期相关。
第二部分NSCLC患者癌中PD-L1的表达水平与Treg在癌中浸润程度及其机制的研究
1)利用TCGA数据及现有的临床标本分析NSCLC患者癌中PD-L1与FOXP3基因水平的相关性。
2)利用流式细胞仪分析新鲜NSCLC临床标本肿瘤细胞PD-L1的表达水平与组织中Treg比例的关系。
3)利用TCGA数据及现有临床标本分析NSCLC患者分析FOXP3mRNA水平在癌与癌旁及不同分期之间的差异。
4)分析NSCLC临床标本癌中FOXP3mRNA表达水平与患者预后的关系。
5)体外利用IFN-γ构建A549高表达PD-L1体系，分为NC、IFN-γ、IFN-γ+PD-L1阻断剂三组，利用细胞多因子筛选试剂盒检测差异趋化因子。
6)利用TCGA数据库及临床样本同时验证NSCLC组织中PD-L1的表达水平与差异趋化因子表达水平及差异趋化因子表达水平与FOXP3水平的相关性。
7)利用免疫组化方法检测临床标本中差异趋化因子与FOXP3的相关性。
8)体外通过细胞系的不同处理后(NC、IFN-γ、IFN-γ+anti-PD-L1、IFN-γ+si-PD-L1、PD-L1过表达、PD-L1过表达+anti-PD-L1)，检测差异趋化因子表达水平的变化。
9)通过网站预测PD-L1调节差异趋化因子表达的可能通路，并进行体外验证。
结果
1)TCGA及临床标本分析表明肿瘤组织中PD-L1mRNA水平与FOXP3呈正相关。
2)流式检测结果表明肿瘤组织中的PD-L1表达水平与Treg的比例呈正相关。
3)FOXP3在癌中的mRNA水平高于癌旁，晚期NSCLC患者高于早期患者。
4)FOXP3高表的患者的预后较低表患者差。
5)通过趋化因子筛试剂盒检测，我们发现CCL5的差异较大。
6)TCGA与临床标本同时检测发现PD-L1与CCL5，CCL5与FOXP3基因水平呈正相关。
7)免疫组化结果表明肿瘤组织中CCL5含量与FOXP3呈正相关。
8)通过检测发现INF-γ处理及PD-L1过表达后肿瘤细胞系表达的CCL5水平明显升高，而IFN-γ+anti-PD-L1、IFN-γ+si-PD-L1、PD-L1过表达+anti-PD-L1组CCL5表达水平都会显著下降。
9)PD-L1可以通过促进AKT/NF-κB磷酸化，促进CCL5的分泌。而且应用AKT和NF-κB抑制剂后，CCL5表达水平显著降低。
小结
1)通过TCGA数据库及临床标本结果表明PD-L1可能通过CCL5促进Treg向肿瘤组织趋化。
2)体外实验表明应用PD-L1阻断剂后可以抑制肿瘤细胞CCL5的分泌。
3)PD-L1通过活化AKT/NF-κB通路调节CCL5的分泌。
第三部分动物模型验证应用PD-L1阻断剂可以降低TregNSCLC组织中的浸润
方法
1)人肺癌细胞系在小鼠皮下成瘤，检测PD-L1对肿瘤生长体积的影响。
2)qPCR检测三组肿瘤组织中CCL5的表达水平。
3)利用免疫组化检测三组CCL5及FOXP3表达的差异。
4)流式检测三组中Treg所占比例及数目的差异。
结果
1)NC组及PD-L1过表达+anti-PD-L1处理组的肿瘤体积小于PD-L1过表达组。
2)NC组及PD-L1过表达+anti-PD-L1处理组的肿瘤组织中CCL5的mRNA表达水平低于PD-L1过表达组。
3)免疫组化结果显示NC组及、PD-L1过表达+anti-PD-L1处理组的肿瘤组织中CCL5及FOXP3的表达水平低于PD-L1过表达组。。
4)NC组及、PD-L1过表达+anti-PD-L1处理组的肿瘤组织中Treg的比例低于PD-L1过表达组。
小结
应用PD-L1阻断剂可以抑制Treg向肺癌组织浸润，降低肿瘤组织中Treg的比例，从而抑制肿瘤的进展。
结论
在NSCLC的肿瘤微环境中，肿瘤细胞表达的PD-L1可以通过AKT/NF-κB通路促进CCL5的分泌，导致Tregs向肿瘤组织趋化。而应用PD-L1阻断剂可以减弱Tregs向NSCLC组织趋化,进而抑制肿瘤的进展。