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禽大肠杆菌病(Avian colibacillosis)是由大肠埃希氏菌的某些血清型引起的一种常见细菌性传染病。自1894年首次报道后,目前呈全球性分布,普遍存在感染及继发感染大肠杆菌病,给世界养禽业造成了严重的经济损失。近年来,在许多病原菌中发现了毒力岛(PAI)的存在,并可能与其毒力进化有关,使得大肠杆菌的致病力更具复杂性；因此做好鸡大肠杆菌的检测与毒力分析十分必要。菌毛是大肠杆菌的重要毒力因子,建立快速特异的检测方法,尤其是研制其单克隆抗体,将有助于禽大肠杆菌菌毛的特性分析。本研究根据文献合成了检测大肠杆菌Ⅲ型分泌系统2(E. coli type three secretion system2, ETT2)毒力岛、肠细胞脱落位点(locus of enterocyte effacement, LEE)毒力岛、耶尔森菌强毒力岛(high-pathogenicity island,HPI)、F1菌毛和P菌毛基因的八对引物。采集江苏省苏北地区疑似大肠杆菌感染病鸡(41例)的病料,运用所合成的引物进行PCR快速检测,结果表明其中4例(9.76%)为LEE+大肠杆菌感染、22例(53.7%)为HPI+大肠杆菌感染、10例(24.4%)为Pap+菌毛大肠杆菌感染、20例(48.8%)为F1+菌毛大肠杆菌感染、17例(41.5%)为ETT2+大肠杆菌感染。通过比较后发现41例临床样品中有14种不同的毒力基因类型。此外,不同类型的大肠杆菌在不同脏器中具有相似的流行病学,在肺脏、十二指肠中,HPI+、ETT2+、Pap+、F1+携带率明显高于肝脏。通过分离获得137株大肠杆菌,检测发现其中56株(40.88%)为F1+大肠杆菌,10株(7.3%)为Pap+大肠杆菌,2株(1.5%)为LEE+大肠杆菌,35株(25.55%)为ETT2+大肠杆菌,34株(24.82%)为HPI+大肠杆菌及确定了分离株有11种不同的毒力因子类型。为了建立F1与P菌毛快速特异的检测方法,根据文献报道合成两对特异性引物,经PCR方法从研究一分离的鸡大肠杆菌菌株(CLu1223-3与CLu1220-6)中分别扩增出相应的基因片段。将两目的片段分别插入到原核表达载体PGEX-6p-1中,获得两个重组菌pGEX-PilA和pGEX-papA,测序结果表明与GenBank己收录的序列同源性分别为97%和100%。将重组质粒导入到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,由SDS-PAGE分析证实PilA与papA基因获得了表达,重组蛋白分子量分别约为44ku和45ku。融合蛋白在大肠杆菌中都以包涵体的形式出现,通过Western-blot分析证明两种蛋白可与鼠抗GST标签单抗发生特异性结合,说明该融合蛋白具有较好的免疫原性。以大肠杆菌表达的重组蛋白(GST-PilA与GST-PapA)为抗原,以一定的免疫程序分别接种BALB/c小鼠后,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按常规杂交瘤技术进行融合,经间接ELISA筛选获得了稳定分泌的抗F1菌毛重组蛋白GST-PilA的杂交瘤细胞株D7、E6和抗P菌毛重组蛋白GST-PapA的杂交瘤细胞株F9；抗体亚类鉴定重链分别为IgG1、IgG1、 IgG2b,轻链均为Kappa型及其腹水抗体效价分别为1：64000、1：128000、1：64000。Western-blot特异性检测结果显示D7、E6分别能与鸡大肠杆菌F1菌毛提取物和F9单抗与P菌毛提取物反应,识别分子量为17-17.5ku、18ku左右的菌毛蛋白,且相互之间无交叉反应。利用单抗检测研究一中分离的鸡大肠杆菌阳性菌株,为进一步建立特异性强、敏感度高、简便快捷的菌毛检测方法奠定了基础。