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牛乳及乳制品因其含有较高的营养价值而受到广大消费者的青睐,但同时牛乳及牛乳制品是导致食物过敏的八大类食物之一,其中α-乳白蛋白是牛乳中的最主要过敏原之一。食物过敏反应是一种免疫学变态反应,其反应的物质基础是抗原表位与抗体对位。开展表位定位及特性研究可深入了解α-乳白蛋白致敏的物质基础,有助于更好地认识α-乳白蛋白在乳过敏反应中的作用,为基于表位靶标而制备低过敏乳制品提供理论指导。本课题以牛乳α-乳白蛋白为研究对象,由亲和纯化牛乳过敏患者的特异性IgE和IgG抗体为靶分子,亲和淘选噬菌体随机肽库,最终通过网络服务器定位出牛乳α-乳白蛋白表位,研究的主要方法、结果及结论如下。1.通过ImmunoCAP,从19位儿童牛乳过敏患者血清中筛选出8个抗牛乳α-乳白蛋白的S-IgE值大于0.35 kUA/l的患者血清,并等体积混合得血清池。利用Sepharose 4B免疫层析柱和Protein G免疫层析柱两步法纯化抗牛乳α-乳白蛋白特异性IgG和IgE抗体,经SDS-PAGE电泳检测结果表明制备的抗牛乳α-乳白蛋白人血清IgG和IgE纯度分别为93.8%和85.3%。2.以特异性IgE和IgG抗体为靶分子,分别对噬菌体随机环七肽库和十二肽库进行亲和淘选,并从第三轮中随机挑选48个克隆子,采用ELISA进行阳性鉴定,通过DNA测序得到模拟肽氨基酸序列,由此获得抗牛乳α-乳白蛋白B细胞结合的线性和构象性模拟表位肽。3.借助UniProt软件,将线性表位模拟肽与牛乳α-乳白蛋白序列进行比对,依据氨基酸的基本性质,定位出七个IgE和六个IgG线性结合表位。其中IgE线性表位序列为AA41-46,AA55-60,AA62-72,AA74-76,AA85-90和AA92-99,IgG线性表位序列为AA37-46,AA52-54,AA56-59,AA63-72,AA74-76,AA81-90和AA92-99。通过对比发现,组成牛乳α-乳白蛋白线性表位的主要氨基酸为天冬氨酸和赖氨酸,其次为天冬酰胺,异亮氨酸和谷氨酰胺。4.通过网络服务器,将环七肽库得到的模拟肽与牛乳α-乳白蛋白进行空间模拟、计算及优化,定位出六个IgE和三个IgG结合的构象性表位。其中IgE构象性表位的序列分别为K62-N71-I75-S76-K79,K62-I75-S76-K79-L81,P24-E25-K114-L115-Q117-L119,L105-H107-K108-L110,V42-Q43-S47-T48-Q65-P67和N44-S47-T48-E49-Y50-K79-L81。IgG结合的构象性表位的序列分别F9-R10-K13-K16-L23-P24-L119,I59-Q65-P67-S69-N71-I75A和Q39-I41-N44-S47-T48。通过序列比对发现,牛乳α-乳白蛋白构象性表位的主要氨基酸为赖氨酸,亮氨酸,异亮氨酸和谷氨酰胺。