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目的:1.研究兔脊髓损伤(Spinal cord injury, SCI)后脑红蛋白(Neuroglobin, Ngb)表达的变化规律;2.兔骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)体外分离、培养及鉴定;3.构建Ngb重组慢病毒并利用其感染BMSCs;4.将Ngb基因修饰的BMSCs植入兔SCI部位,观察其在脊髓内存活、基因表达、蛋白分泌以及对兔SCI的治疗作用;5.探讨Ngb基因修饰的BMSCs保护SCI的可能机制。方法:1.采用球囊压迫制作兔脊髓不完全损伤模型;应用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和蛋白质印迹(Western blot)法检测SCI后不同时间点损伤区脊髓组织中Ngb mRNA和蛋白的表达;2.采用密度梯度离心与贴壁筛选法相结合培养BMSCs,用流式细胞仪检测BMSCs表面标记物;3.构建携带Ngb基因的重组慢病毒载体,在脂质体Lipofectamine 2000作用下转染293T细胞,Real-time PCR检测慢病毒滴度;以Ngb重组慢病毒感染BMSCs,通过荧光表达法判定感染复数(Multiplicities of infection, MOI),Real-time PCR、Western blot和酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)判定感染后的BMSCs中Ngb的表达情况;4.SCI兔分别给予NS、BMSCs、EGFP-BMSCs、LV-Ngb及Ngb-BMSCs治疗,通过BBB评分观察兔后肢运动功能;在荧光显微镜下观察损伤脊髓组织的荧光表达,Real-time PCR和Western blot法检测损伤脊髓组织中Ngb的表达;5.丙二醛(Malondialdehyde, MDA)测试盒检测损伤脊髓组织中MDA水平的变化,脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法( TdT-mediated UTP nick end labeling, TUNEL)检测凋亡指数(Apoptosis index, AI)的变化。结果:1.Ngb mRNA和蛋白在无损伤脊髓组织中即见有表达,SCI后6 h表达明显上调,与对照组比有显著性差异;随着损伤后时间的延长,表达逐渐增高,于损伤后24 h达到高峰,此后高表达仍持续至伤后72 h(与对照组比有非常显著性差异(P <0.01));72 h后表达逐渐减少,至本研究观察最后时间点SCI后7 d,表达明显下降,并接近正常水平,与对照组比无显著性差异(P >0.05) ;2.成功分离、培养、扩增BMSCs,应用流式细胞仪检测BMSCs的表面标志,显示CD29、CD90表达阳性,而CD34、CD45表达阴性,符合BMSCs特征;3.构建Ngb重组慢病毒载体,经酶切及测序鉴定完全正确,能够转染293T细胞并表达,滴度为2×108 TU/ml,Ngb重组慢病毒感染BMSCs最佳MOI值为100,且Ngb重组慢病毒感染BMSCs能持续稳定高水平表达Ngb mRNA和蛋白;4.与NS组相比,BMSCs组、EGFP/BMSCs组、LV-Ngb组和Ngb/BMSCs组动物后肢运动功能明显改善,Ngb/BMSCs组改善最显著;EGFP/BMSCs组、LV-Ngb组和Ngb/BMSCs组损伤脊髓组织在荧光显微镜下可观察到有EGFP表达的绿色荧光信号;Real-time PCR和Western blot结果显示LV-Ngb组和Ngb/BMSCs组损伤脊髓组织中Ngb表达都增高,且Ngb/BMSCs组增高更明显;5.与NS组相比,BMSCs组、EGFP/BMSCs组、LV-Ngb组和Ngb/BMSCs组动物的MDA水平及AI水平都明显下降,Ngb/BMSCs组下降最显著。结论:1.Ngb的表达变化与SCI的时间密切相关,其表达水平上调可能是机体的一种内源性保护反应;2.通过密度梯度离心与贴壁筛选法相结合培养BMSCs,可得到纯度较高同源性较好的BMSCs,经多次传代仍保持稳定的生物学特性;3.成功构建Ngb重组慢病毒,并将Ngb基因成功整合至BMSCs中,实现Ngb的持续稳定高水平表达;4. Ngb基因修饰的BMSCs移植后可在SCI部位存活,并稳定持续高表达Ngb,明显地促进兔SCI后运动功能的恢复,对SCI具有保护作用;5.Ngb基因修饰的BMSCs移植对SCI后的神经保护作用的可能机制是:通过抗氧化、抗凋亡来保护损伤脊髓。