【摘 要】
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目的阐明间充质干细胞条件培养基（mesenchymal stem cells conditioned medium,MSCs-CM）对氧化损伤神经细胞的保护作用及其潜在机制。方法1.采用100μmol/L的H2O2处理小鼠海马神经元细胞系（HT22细胞）1h建立体外神经细胞氧化应激损伤模型,收集脐带来源MSCs-CM,离心浓缩MSCs-CM并利用蛋白芯片技术检测其成分;2.利用MSCs-CM培养经
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目的阐明间充质干细胞条件培养基（mesenchymal stem cells conditioned medium,MSCs-CM）对氧化损伤神经细胞的保护作用及其潜在机制。方法1.采用100μmol/L的H2O2处理小鼠海马神经元细胞系（HT22细胞）1h建立体外神经细胞氧化应激损伤模型,收集脐带来源MSCs-CM,离心浓缩MSCs-CM并利用蛋白芯片技术检测其成分;2.利用MSCs-CM培养经H2O2处理后的HT22细胞,采用细胞免疫荧光染色和Western Blot检测凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9的表达并评价MSCs-CM的治疗效果;3.采用流式细胞术检测MSCs-CM处理前后氧化损伤的HT22细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）的水平变化,并结合Western Blot检测抗氧化蛋白SOD的表达,进一步评价MSCs-CM是否通过其抗氧化能力发挥对神经细胞的保护作用;4.采用细胞免疫荧光染色检测MSCs-CM处理前后氧化损伤的HT22细胞内TRPM2蛋白的表达,利用全细胞膜片钳技术检测MSCs-CM处理前后氧化损伤的HT22细胞TRPM2样电流的变化,评价MSCs-CM是否通过抑制细胞TRPM2通道发挥修复作用;5.采用Western Blot检测MAPK信号通路相关蛋白p-JNK1/2/3、p-ERK1/2和p-P38的蛋白表达,评价MSCs-CM是否参与MAPK信号通路调控发挥其修复作用;6.随机将18只C57BL/6J小鼠分为假手术组、大脑中动脉闭塞再灌注（MCAO/R）组和MSCs-CM组,建立小鼠MCAO/R模型,并采用Zea-Longa行为学评分及TTC染色评价造模是否成功;7.采用HE染色与尼氏染色观察MSCs-CM治疗各组小鼠大脑损伤区组织形态学的变化,免疫荧光染色观察各组小鼠大脑半暗带区神经细胞凋亡及TRPM2表达情况,评价MSCs-CM的治疗效果。结果1.MSCs-CM处理氧化损伤的HT22细胞后降低了H2O2诱导的Cleaved-Caspase-3阳性细胞比例和Cleaved-Caspase-9蛋白的表达水平（P＜0.05）。2.与H2O2组相比,MSCs-CM组的细胞内ROS水平明显下降,抗氧化蛋白SOD的表达水平明显增加（P＜0.05）。3.MSCs-CM处理氧化损伤的HT22细胞减弱了H2O2诱导的TRPM2样电流（P＜0.05）。4.通过检测获取MSCs-CM的成分,利用DAVID数据库对MSCs-CM的成分进行GO富集分析与KEGG富集分析,结果显示MSCs-CM参与酪氨酸磷酸化及修饰、细胞间粘附调节、MAP激酶活性的调节等,主要富集在MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、Ras信号通路等多条信号通路。5.H2O2氧化损伤HT22细胞,其p-JNK1/2/3蛋白表达明显下降,而经MSCs-CM处理后这种下降趋势被逆转（P＜0.05）。6.经MSCs-CM治疗的脑缺血小鼠,受损区域的神经细胞及尼氏小体数增加,核膜及核仁较清晰,且半暗带区的神经细胞凋亡及TRPM2的荧光信号减弱。结论1.脐带来源的MSCs-CM具有一定的抗氧化能力,对氧化损伤的神经细胞具有保护作用。2.脐带来源的MSCs-CM是通过抑制TRPM2激活,调节MAPK-JNK信号通路发挥其神经保护功能。
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