沙门氏菌是一种重要的食源性致病菌,随着抗生素的大量及不合理使用,多重耐药沙门氏菌频繁出现。多黏菌素被认为是治疗临床耐药革兰氏阴性菌感染的最后一道防线。然而,随着多黏菌素使用的增加,多黏菌素耐药现象日益严重,多黏菌素耐药机制成为近年来的研究热点。多黏菌素耐药机制十分复杂,其中由双组分系统介导的脂多糖修饰是多黏菌素耐药沙门氏菌出现的重要原因。BaeSR双组分系统是沙门氏菌中重要的调控系统,与细菌耐药性密切相关。然而,目前尚未见BaeSR双组分系统对沙门氏菌多黏菌素耐药性贡献的研究。因此,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了体外诱导多黏菌素耐药鼠伤寒沙门氏菌（AT-P128）的baeR,acrB单基因及双基因缺失株,并在acrB单基因缺失株中,借助p UC19质粒对baeR基因进行过表达。对不同菌株的生长速度、多黏菌素敏感性、运动性和生物膜形成能力进行了测定。采用不同浓度的多黏菌素进行了时间杀伤试验。通过转录组测序和RT-qPCR比较各菌株间基因表达水平的差异。最后通过脂多糖提取、银染和N-苯基-1-萘胺（NPN）吸收试验比较了不同菌株间脂多糖含量和外膜通透性的差异。主要研究内容及结果如下:1.基因缺失株、过表达株的构建及多黏菌素敏感性测定:采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建AT-P128的baeR,acrB单基因及双基因缺失株,并在acrB单基因缺失株中对baeR基因进行了过表达,PCR鉴定和测序结果表明基因缺失株和过表达株构建成功。微量肉汤稀释法测定了所有菌株的多黏菌素敏感性。结果发现,与原始耐药株（AT-P128）相比,除了baeR过表达株（AT-P128ΔacrB/pbaeR）的多黏菌素敏感性显著增加了8倍（MIC=16 mg/L）外,其余菌株的多黏菌素敏感性均无明显变化（MIC=128 mg/L）。将AT-P128ΔacrB,AT-P128ΔacrBΔbaeR和AT-P128ΔacrB/pbaeR在含有不同浓度多黏菌素的肉汤培养基中培养,结果发现,在不同浓度多黏菌素培养下,AT-P128ΔacrB/pbaeR菌株均表现出更高的敏感性。2.不同菌株的生物学特性研究:对不同菌株的生长速度、运动性和生物膜形成能力进行了测定和比较。结果发现,基因缺失和过表达前后菌株的生长速度未发生显著变化,表明baeR,acrB基因缺失和baeR过表达并不影响菌株的生长速度;对ATP128ΔacrB、AT-P128ΔacrBΔbaeR和AT-P128ΔacrB/pbaeR三株菌株的运动性和生物膜形成能力进行了测定,结果发现,与AT-P128ΔacrB相比,AT-P128ΔacrBΔbaeR菌株的生物膜形成能力和运动性均未发生显著变化,而AT-P128ΔacrB/pbaeR菌株的生物膜形成能力和运动性均显著提高,表明在acrB基因缺失的背景下,baeR过表达可以显著提高菌株的生物膜形成能力和运动性。3.AT-P128ΔacrB、AT-P128ΔacrBΔbaeR和AT-P128ΔacrB/pbaeR的转录组学分析:以|log2（Fold Change）|＞1且p＜0.05为标准筛选显著差异表达基因,结果ATP128ΔacrBΔbaeR/AT-P128ΔacrB比较组中共筛选到2 343个显著差异表达基因,其中1 478个上调,865个下调;（AT-P128ΔacrB/pbaeR）/AT-P128ΔacrB比较组中共筛选到1 820显著差异表达基因,其中1 033个上调,787个下调。从中筛选与多黏菌素耐药相关的差异表达基因,结果发现,与AT-P128ΔacrB相比,AT-P128ΔacrB/pbaeR中包括pho PQ,pmr D、pmr AB、arn T、arn C、arn A、ept B、pag C、pag L和lpx D在内的多个多黏菌素耐药相关基因的表达量均显著下调。除此之外,与AT-P128ΔacrB菌株相比,AT-P128ΔacrB/pbaeR菌株中baeR基因的表达量显著增加3 399倍。结果表明,在acrB基因缺失的背景下,baeR过表达影响多黏菌素耐药相关基因的表达,通过pho PQ-pmr D-pmr AB-arn BCADTEF或其他通路调节鼠伤寒沙门氏菌的多黏菌素敏感性。4.脂多糖含量和外膜通透性比较:采用脂多糖提取试剂盒（LPS Extraction Kit）提取AT-P128ΔacrB、AT-P128ΔacrBΔbaeR和AT-P128ΔacrB/pbaeR三株菌株的脂多糖,并进行SDS-PAGE和脂多糖银染。结果发现,与AT-P128ΔacrB相比,ATP128ΔacrBΔbaeR和AT-P128ΔacrB/pbaeR中的脂多糖含量略有降低,但并不显著,表明baeR过表达并不能使脂多糖含量显著降低而引起多黏菌素敏感性增加。采用NPN吸收试验对AT-P128ΔacrB、AT-P128ΔacrBΔbaeR和AT-P128ΔacrB/pbaeR三株菌株的外膜通透性进行了比较。结果发现,与AT-P128ΔacrB相比,AT-P128ΔacrBΔbaeR和AT-P128ΔacrB/pbaeR菌株的外膜通透性均有所增加,其中AT-P128ΔacrB/pbaeR更为显著,表明BaeSR影响细菌的外膜通透性,并可能通过改变外膜通透性影响细菌的多黏菌素敏感性。本研究揭示了BaeSR双组分系统对沙门氏菌多黏菌素耐药性的贡献,为多黏菌素耐药机制的深入研究提供重要依据。