X染色体失活（X chromosome inactivation,XCI）是雌性哺乳动物通过一条X染色体的转录沉默来实现两性间X连锁基因表达的剂量补偿。大量研究表明X染色体活性状态与哺乳动物胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC）的多能性及分化能力等密切相关。猪胚胎干细胞是生物医学研究中一个极好的材料,但是到目前为止,尚未获得能够参与生殖系嵌合、具有na?ve（初始态）多能性的猪ESC。阐明已建系的猪胚胎干细胞中的X染色体活性状态及其调控机制将有助于na?ve多能性干细胞的建系及其应用,也有望为早期胚胎发育过程中XCI机制研究建立体外模型。本研究利用邓宏魁课题组开发的扩展多能干细胞培养体系（LCDM体系）建立了猪孤雌胚胎干细胞系,并将其命名为pp LCDM。对pp LCDM的多能性状态和分化能力进行了系统评价,在传代过程中检测了pp LCDM的X染色体活性状态及多能性变化。结果显示,pp LCDM碱性磷酸酶染色呈阳性,表达核心转录因子OCT4、SOX2、NANOG,在体外能够自发分化形成拟胚体（embryoid body,EB）并表达三胚层标志物,具有典型的胚胎干细胞的特征。对pp LCDM分化后的XCI情况进行检测,结果表明pp LCDM分化后一条X染色体失活。利用免疫荧光标记跟踪H3K27me3状态,采用FISH跟踪XIST表达情况,对传代过程中pp LCDM细胞的X染色体失活情况进行评价。结果发现,在传代过程中H3K27me3凝集信号迅速增加,第25代时绝大部分细胞具有一个XCI凝集信号。但是,当培养到第35代时,观察到H3K27me3凝集信号呈现两种状态:一种是克隆中大多数细胞具有凝集信号,另一种是克隆中部分细胞的H3K27me3凝集信号丢失。XIST RNA FISH结果也显示XIST信号与H3K27me3高度吻合,尤其是在第35代时XIST也呈现两种状态:一种是在大部分细胞中维持点状信号,一种是在部分细胞中XIST表达丢失。以上H3K27me3和XIST检测结果提示猪胚胎干细胞中也存在类似于primed（始发态）h ESC的侵蚀（erosion）现象。为进一步验证以上结果,对不同代次的pp LCDM细胞进行了单细胞RNA测序,采用雄性LCDM细胞作为对照,从XIST表达、雌雄细胞中X连锁基因表达的比值（Female X/Male X）、X染色体与常染色体基因表达的比值（X/A）等方面进行了分析。结果表明随着代次的增加,在第15代时X/A与雄性相当,Female X/Male X比值接近于1,表明基本完成了X染色体失活。第35代左右出现两种状态:部分细胞类似于有一条X染色体失活的Class II primed h ESC,Female X/Male X和X/A比值与第15代相近,处于失活状态;另一部分细胞中XIST表达降低,Female X/Male X和X/A比值升高,处于类侵蚀状态。这些结果与H3K27me3免疫荧光和XIST RNA FISH检测结果相吻合。最后,本研究分析了发生类侵蚀后细胞中的多能性变化。分析结果表明,第35代中发生类侵蚀的细胞（P35-II型）在多能性基因表达上与未完成失活的第0代细胞相似;两种类型的第35代细胞中primed标志基因的表达高于未完成失活的第0代细胞,部分na?ve标志基因表达低于第0代细胞,表明pp LCDM细胞在传代过程中多能性逐渐降低;值得关注的是,发生类侵蚀的细胞中na?ve标志基因表达高于未发生类侵蚀的细胞（P35-I型）,primed标志基因表达无明显差异。综上所述,我们的研究结果表明猪孤雌胚胎干细胞传代过程中多能性和X染色体活性状态不稳定,存在类似于primed h ESCs中的侵蚀现象。