血友病(Hemophilia)是一种常见的凝血功能障碍性遗传病,通常是先天性凝血因子的缺乏,症状为极易受伤出血并可能出血不止,严重的甚至无明显外伤也会自发性出血,其中甲型血友病(Hemophilia A)又叫凝血第八因子(FactorⅧ)缺乏症,它是凝血因子Ⅷ编码基因突变导致该凝血因子功能缺陷所致的一种凝血功能障碍性遗传病,目前最成熟和有效的治疗方法为补充FactorⅧ,且需终身用药。若长效化制剂得以实现,将大幅提高患者顺应性。蛋白药物须通过注射给药,制剂的长效化是一项难度较大的技术挑战。目前只有少数分子量较小的蛋白药物通过化学或生物改构,延长了体内半衰期,达到了每周一针甚至每两周一针的效果。改构延长半衰期的方案也从未在FactorⅧ这样的数十万分子量的大蛋白上获得成功。蛋白以自然形态实现长效缓释注射的制剂经业界41年研究没有产生产品。本实验室积累了一系列针对脆弱易变蛋白大分子的长效缓释微球制备技术,如水相-水相乳液法和冷冻相分离法蛋白预制剂技术、膜乳化沉降法微球制备技术和基于相导向的多孔微球包封法等,克服了导致蛋白长效缓释注射剂至今未有成功的产品的一系列久攻不克的技术难题。一些分子量相对较小的蛋白药物的长效缓释微球(如促红细胞生成素和生长素)已进入产业化开发阶段。然而,FactorⅧ的分子量远远大于绝大多数细胞因子类蛋白药物,在长效缓释微球制备中如何保证其构象稳定性,实现理想的释放动力学面临着更加艰巨的技术挑战。为了探讨将FactorⅧ制备成长效缓释微球的可行性,本研究采取了两种不同的微球制备策略:1)采用冷冻相分离法,在不接触水-油和水-气界面(已知的蛋白构象杀手)的前提下,将蛋白药物预包封于多糖微粒,再进一步运用所在实验室发明的膜乳化沉降微球制备工艺,将蛋白颗粒包封于具有长效缓释功能的可降解聚合物微球。2)将可降解聚合物预制备成多孔微球,通过相导向分配法,将蛋白载于多孔微球,最后降低聚合物相变温度封孔。扫描电镜观察、激光散色粒度分析、体外释放动力学考察、ELISA定量分析等一系列实验结果表明,所制得的凝血第八因子微球的平均粒径为39.1±8.1μm,蛋白包封率接近90%。通过在PEG20000溶液中的热处理,PLGA多孔微球可在低于其Tg温度(37度)下关孔。体外释放结果显示由多孔微球基于相导向分配法制得的微球在不同关孔程度下,显示了递减的释放速率,但初期有较大的突释。膜乳化沉降法制得的微球则释放速率过慢,以致测不出FactorⅧ的释放。两个制剂的FactorⅧ的释放分别过快和过慢,理想的释放速率当在两者之间。鉴于,我们在前期实验中验证过采取我们的保护措施后包封的FactorⅧ的活性得到了很好的保护,上述体外释放结果显示我们的微球制备方案进一步优化后能够实现FactorⅧ的长效缓释是可行的。