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目的:
通过建立Lewis肺癌荷瘤小鼠模型，运用免疫组化法检测调衡方对Lewis肺癌荷瘤小鼠模型肺脏、脾脏细胞中Foxp3、TGF-β、IL-10的影响。在本课题研究对Lewis肺癌荷瘤小鼠瘤体免疫微环境Foxp3、TGF-β、IL-10的影响的基础上，观察调衡方不同用药量对肺脏、脾脏的保护作用。探讨调衡方运用中医学“即病防变”、“先安未受邪之地”理论抑制肿瘤的传变机制，健全调衡方对肿瘤抑制作用的实验数据支撑。
方法:
C57BL/6小鼠50只，随机分为五组，每组10只：分别为空白组、模型对照组(Modelcontrol,MC)、调衡方小剂量组（LowdoseTiaohengformulatreated，LDTFT）、调衡方中剂量组（MiddledoseTiaohengformulatreated，MDTFT）、调衡方大剂量组（HighdoseTiaohengformulatreated，HDTFT）。建立Lewis肺癌C57BL/6小鼠模型：以1.3×106/ml的浓度把经传代培养的活性较强的Lewis肺癌细胞悬液接种于C57BL/6小鼠右前腋下，接种后24h，开始每天对各组进行一次灌胃,空白组、模型对照组按照体重每只给予生理盐水0.1ml/10g。依据成人用药剂量换算为小鼠用药量给予调衡方大、中、小剂量组小鼠灌胃。调衡方大剂量组，小鼠每只用药量为50g/Kg；调衡方中剂量，小鼠每只用药量为25g/Kg；调衡方小剂量小鼠每只用药量为12.5g/Kg。将调衡方生药浓缩至各组所需浓度（调衡方大、中、小剂量组灌胃药物含量分别为：0.5g/ml、2.5g/ml、1.25g/ml），0.1ml/10g的体积用药，每日一次,连续灌胃10天。于末次给药24h，断水断粮8h后进行颈部脱臼法处死小鼠，取眼球血，对血清中IL-10、TGF-β进行ELISA检测。取出小鼠肺脏、脾脏，浸入10%的福尔马林溶液中48h。然后进行常规肺脏、脾脏组织石蜡标本的制作，切片进行HE染色，镜下观察各组小鼠肺脏、脾脏的组织细胞变化。确定HE染色切片的结果是肿瘤转移至肺脏，进行肺脏、脾脏Foxp3、TGF-β、IL-10阳性率的免疫组化检测。用ImageProPlus6.0图像分析软件计算蛋白阳性表达百分率。
结果:
(1)各实验组小鼠血清IL-10、TGF-β的ELISA检测结果
与空白组相比：模型组中IL-10、TGF-β的含量显著增高（P﹤0.01），调衡方大、中、小剂量组含量明显增多（P﹤0.05），有统计学意义。但与模型组相比较，调衡方大剂量组IL-10、TGF-β的含量均显著降低（P=0.000），中剂量组含量也明显降低（P﹤0.05），有统计学意义。调衡方大、中剂量组显示出了明显的抑制血清IL-10、TGF-β含量的作用。
(2)HE染色结果：普通光镜下正常组小鼠肺泡边界轮廓清楚，未有肿瘤转移灶。模型组小鼠肺组织可见细胞排列混乱的肿瘤转移灶，细胞形状不规则，分布集中，细胞核大、染色深，病理性的核分裂较多，染色较深，肿瘤实、间质间边缘不清；调衡方大、中、小剂量组较模型组细胞分布相对均匀，随给药剂量的增大肺泡边界越发清晰，细胞排列与空白组小鼠越为接近，调衡方中、小剂量组肿瘤细胞有肿瘤转移灶形成迹象，而调衡方大剂量组则没有明显的肿瘤细胞聚集，随着剂量的增大治疗效果逐步增强。镜下脾脏HE染色可判断，与空白组相比，各调衡方治疗组Lewis肺癌荷瘤小鼠脾组织细胞排列明显紊乱，细胞形态多有变化，细胞间隙较大，细胞间有明显出血；但较模型组排列规则，细胞形态较为规整，但仍随着调衡方剂量的减少，细胞形态变化逐渐接近模型组，各治疗组中调衡方小剂量组的脾组织细胞学形态变化较多，但较模型组有明显的好转。各调衡方治疗组随着调衡方剂量增大小鼠脾组织细胞排列、形态逐渐与空白组小鼠正常脾组织接近，且明显可见调衡方大剂量组效果最为明显。说明造模成功，随着调衡方剂量的增大，治疗效果逐渐增强，大剂量组效果最为明显。
(3)Lewis肺癌荷瘤小鼠肺脏Foxp3、IL-10、TGF-β阳性表达率数据分析显示：与空白组相比，模型组、调衡方中、小剂量组阳性表达率均具有显著性增高（P＜0.01），调衡方大剂量组阳性表达率差异具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，调衡方大、中、小剂量Foxp3、IL-10、TGF-β蛋白阳性表达率均具有显著性降低（P＜0.01），表明调衡方大、中、小剂量均能抑制lewis肺癌荷瘤小鼠肺脏的转移，降低Foxp3、IL-10、TGF-β蛋白阳性表达维护肺脏组织细胞，且调衡方大剂量组效果最为显著。与调衡方大剂量组相比，Foxp3蛋白阳性表达率中、小剂量组均有统计学差异（P＜0.05）；IL-10、TGF-β蛋白阳性表达率中、小剂量组均有显著性差异（P＜0.01）。调衡方中、小剂量组间相较显示，Foxp3、IL-10、TGF-β蛋白阳性表达率均具有统计学差异（P＜0.05）。
(4)Lewis肺癌荷瘤小鼠脾脏组织中Foxp3、IL-10、TGF-β阳性表达率数据分析显示：与空白组相比，各实验组Foxp3、IL-10、TGF-β阳性表达百分率均增高，具有显著差异（P＜0.01）；与模型组相比，调衡方大、中、小剂量组Foxp3、IL-10、TGF-β阳性表达率均降低，具有显著差异（P＜0.01）。结果显示，调衡方大、中、小剂量组对脾脏组织中Foxp3、IL-10、TGF-β阳性表达具有抑制作用，调衡方对lewis肺癌荷瘤小鼠脾脏具有预防保护作用。与调衡方大剂量组相比，调衡方中剂量组Foxp3、IL-10、TGF-β的阳性表达率均有差异，有统计学意义（P＜0.05）；调衡方小剂量组Foxp3、IL-10、TGF-β的阳性表达率均有显著差异（P＜0.01）。调衡方大、中剂量组间比较，Foxp3、IL-10、TGF-β的阳性表达率均有统计学意义（P＜0.05）。
结论:
(1)调衡方可明显降低Lewis肺癌荷瘤小鼠肺转移模型小鼠血清TGF-β、IL-10的含量。
(2)调衡方能够抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠肺转移，降低Foxp3、TGF-β、IL-10在小鼠肺脏的表达，起到了保护肺脏、抑制肿瘤细胞肺转移的作用。
(3)调衡方能够保护Lewis肺癌荷瘤小鼠的脾脏，降低Foxp3、TGF-β、IL-10在小鼠脾脏Foxp3、TGF-β、IL-10的表达。
(4)调衡方可能通过抑制Foxp3、TGF-β、IL-10这些能够促进肿瘤转移的蛋白表达来实现抑制肿瘤的转移。
通过建立Lewis肺癌荷瘤小鼠模型，运用免疫组化法检测调衡方对Lewis肺癌荷瘤小鼠模型肺脏、脾脏细胞中Foxp3、TGF-β、IL-10的影响。在本课题研究对Lewis肺癌荷瘤小鼠瘤体免疫微环境Foxp3、TGF-β、IL-10的影响的基础上，观察调衡方不同用药量对肺脏、脾脏的保护作用。探讨调衡方运用中医学“即病防变”、“先安未受邪之地”理论抑制肿瘤的传变机制，健全调衡方对肿瘤抑制作用的实验数据支撑。
方法:
C57BL/6小鼠50只，随机分为五组，每组10只：分别为空白组、模型对照组(Modelcontrol,MC)、调衡方小剂量组（LowdoseTiaohengformulatreated，LDTFT）、调衡方中剂量组（MiddledoseTiaohengformulatreated，MDTFT）、调衡方大剂量组（HighdoseTiaohengformulatreated，HDTFT）。建立Lewis肺癌C57BL/6小鼠模型：以1.3×106/ml的浓度把经传代培养的活性较强的Lewis肺癌细胞悬液接种于C57BL/6小鼠右前腋下，接种后24h，开始每天对各组进行一次灌胃,空白组、模型对照组按照体重每只给予生理盐水0.1ml/10g。依据成人用药剂量换算为小鼠用药量给予调衡方大、中、小剂量组小鼠灌胃。调衡方大剂量组，小鼠每只用药量为50g/Kg；调衡方中剂量，小鼠每只用药量为25g/Kg；调衡方小剂量小鼠每只用药量为12.5g/Kg。将调衡方生药浓缩至各组所需浓度（调衡方大、中、小剂量组灌胃药物含量分别为：0.5g/ml、2.5g/ml、1.25g/ml），0.1ml/10g的体积用药，每日一次,连续灌胃10天。于末次给药24h，断水断粮8h后进行颈部脱臼法处死小鼠，取眼球血，对血清中IL-10、TGF-β进行ELISA检测。取出小鼠肺脏、脾脏，浸入10%的福尔马林溶液中48h。然后进行常规肺脏、脾脏组织石蜡标本的制作，切片进行HE染色，镜下观察各组小鼠肺脏、脾脏的组织细胞变化。确定HE染色切片的结果是肿瘤转移至肺脏，进行肺脏、脾脏Foxp3、TGF-β、IL-10阳性率的免疫组化检测。用ImageProPlus6.0图像分析软件计算蛋白阳性表达百分率。
结果:
(1)各实验组小鼠血清IL-10、TGF-β的ELISA检测结果
与空白组相比：模型组中IL-10、TGF-β的含量显著增高（P﹤0.01），调衡方大、中、小剂量组含量明显增多（P﹤0.05），有统计学意义。但与模型组相比较，调衡方大剂量组IL-10、TGF-β的含量均显著降低（P=0.000），中剂量组含量也明显降低（P﹤0.05），有统计学意义。调衡方大、中剂量组显示出了明显的抑制血清IL-10、TGF-β含量的作用。
(2)HE染色结果：普通光镜下正常组小鼠肺泡边界轮廓清楚，未有肿瘤转移灶。模型组小鼠肺组织可见细胞排列混乱的肿瘤转移灶，细胞形状不规则，分布集中，细胞核大、染色深，病理性的核分裂较多，染色较深，肿瘤实、间质间边缘不清；调衡方大、中、小剂量组较模型组细胞分布相对均匀，随给药剂量的增大肺泡边界越发清晰，细胞排列与空白组小鼠越为接近，调衡方中、小剂量组肿瘤细胞有肿瘤转移灶形成迹象，而调衡方大剂量组则没有明显的肿瘤细胞聚集，随着剂量的增大治疗效果逐步增强。镜下脾脏HE染色可判断，与空白组相比，各调衡方治疗组Lewis肺癌荷瘤小鼠脾组织细胞排列明显紊乱，细胞形态多有变化，细胞间隙较大，细胞间有明显出血；但较模型组排列规则，细胞形态较为规整，但仍随着调衡方剂量的减少，细胞形态变化逐渐接近模型组，各治疗组中调衡方小剂量组的脾组织细胞学形态变化较多，但较模型组有明显的好转。各调衡方治疗组随着调衡方剂量增大小鼠脾组织细胞排列、形态逐渐与空白组小鼠正常脾组织接近，且明显可见调衡方大剂量组效果最为明显。说明造模成功，随着调衡方剂量的增大，治疗效果逐渐增强，大剂量组效果最为明显。
(3)Lewis肺癌荷瘤小鼠肺脏Foxp3、IL-10、TGF-β阳性表达率数据分析显示：与空白组相比，模型组、调衡方中、小剂量组阳性表达率均具有显著性增高（P＜0.01），调衡方大剂量组阳性表达率差异具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，调衡方大、中、小剂量Foxp3、IL-10、TGF-β蛋白阳性表达率均具有显著性降低（P＜0.01），表明调衡方大、中、小剂量均能抑制lewis肺癌荷瘤小鼠肺脏的转移，降低Foxp3、IL-10、TGF-β蛋白阳性表达维护肺脏组织细胞，且调衡方大剂量组效果最为显著。与调衡方大剂量组相比，Foxp3蛋白阳性表达率中、小剂量组均有统计学差异（P＜0.05）；IL-10、TGF-β蛋白阳性表达率中、小剂量组均有显著性差异（P＜0.01）。调衡方中、小剂量组间相较显示，Foxp3、IL-10、TGF-β蛋白阳性表达率均具有统计学差异（P＜0.05）。
(4)Lewis肺癌荷瘤小鼠脾脏组织中Foxp3、IL-10、TGF-β阳性表达率数据分析显示：与空白组相比，各实验组Foxp3、IL-10、TGF-β阳性表达百分率均增高，具有显著差异（P＜0.01）；与模型组相比，调衡方大、中、小剂量组Foxp3、IL-10、TGF-β阳性表达率均降低，具有显著差异（P＜0.01）。结果显示，调衡方大、中、小剂量组对脾脏组织中Foxp3、IL-10、TGF-β阳性表达具有抑制作用，调衡方对lewis肺癌荷瘤小鼠脾脏具有预防保护作用。与调衡方大剂量组相比，调衡方中剂量组Foxp3、IL-10、TGF-β的阳性表达率均有差异，有统计学意义（P＜0.05）；调衡方小剂量组Foxp3、IL-10、TGF-β的阳性表达率均有显著差异（P＜0.01）。调衡方大、中剂量组间比较，Foxp3、IL-10、TGF-β的阳性表达率均有统计学意义（P＜0.05）。
结论:
(1)调衡方可明显降低Lewis肺癌荷瘤小鼠肺转移模型小鼠血清TGF-β、IL-10的含量。
(2)调衡方能够抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠肺转移，降低Foxp3、TGF-β、IL-10在小鼠肺脏的表达，起到了保护肺脏、抑制肿瘤细胞肺转移的作用。
(3)调衡方能够保护Lewis肺癌荷瘤小鼠的脾脏，降低Foxp3、TGF-β、IL-10在小鼠脾脏Foxp3、TGF-β、IL-10的表达。
(4)调衡方可能通过抑制Foxp3、TGF-β、IL-10这些能够促进肿瘤转移的蛋白表达来实现抑制肿瘤的转移。