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乙酰乳酸合酶(acetohydroxyacid synthase,AHAS)是参与支链氨基酸合成途径的限速酶,催化该途径的第一步反应。AHAS分布在细菌,酵母及高等植物体内,目前动物体内未发现AHAS基因,因此AHAS便成为筛选除草剂的重要靶标。但其可溶性表达低且易失活,因此,研究其制备及保存方法均具有很大的意义。AHAS的作用底物有丙酮酸,2-丁酮酸及苯甲醛等,其作用底物的广谱性为开发其功能奠定了良好的基础。AHAS为一种ThDP依赖酶,目前,对ThDP依赖酶催化机制的研究还有很多问题需要阐明,对AHAS催化机制的研究有助于阐明ThDP依赖酶的催化机制。本研究围绕大肠杆菌I型乙酰乳酸合酶(AHAS Ⅰ)为核心展开,对其克隆表达纯化,酶功能以及酶催化机制进行了研究。本研究选择pGEX-4T-1作为表达载体,成功构建了带有AHAS Ⅰ催化亚基(ilvB)的pGEX-4T-1-ilvB重组质粒,将它用热击法转入E. coli BL21(DE3)中,并用IPTG诱导其表达。利用pGEX-4T-1载体表达的蛋白均具有谷胱甘肽巯基转移酶(GST)标签的特点,用谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱对其进行纯化,得到带有GST标签的重组AHAS Ⅰ。从SDS-PAGE和Western blot的结果来看,所得到的重组融合AHAS Ⅰ分子量为80KDa,其可溶性表达有了较大幅度提高,且纯度在95%以上,Bradford法测定重组蛋白的浓度为0.52mg/mL,其比活力为104.2U/mg。且由于pGEX-4T-1载体的表达优点以及我们选用的保存缓冲液的共同作用,本研究提高了AHAS Ⅰ的稳定性,其活性至少可以保存8个月。本研究还对AHAS Ⅰ的功能进行了研究,由于其作用底物的广谱性,我们选取了丙酮酸和2-丁酮酸以及苯甲醛三个底物进行研究。首先,用得到的AHAS Ⅰ酶法合成了食用香料2,3-丁二酮和2,3-戊二酮,并用邻苯二胺比色法对该反应进行评估,单独以丙酮酸作为底物时,2,3-丁二酮的产率可以达到76%。然后,用得到的AHAS Ⅰ酶法合成了重要的药物合成前体L-苯基乙酰基甲醇(L-PAC),得到了纯度高达95%以上的L-PAC。同时,对AHAS Ⅰ催化苯甲醛和丙酮酸合成L-PAC的反应体系从反应温度,反应体系pH,反应时间,萃取溶剂等方面进行优化,最终确定最佳反应条件为：在30℃,pH为7.0条件下,反应1h,用氯仿进行萃取,可以使L-PAC的产率达到最高,可达72%。由于酶法合成L-PAC纯度高,且整个过程环境友好,因此,AHAS Ⅰ酶法合成L-PAC是一条很有前景的L-PAC合成途径。AHAS Ⅰ为一种硫胺素焦磷酸依赖酶,本研究还以AHAS Ⅰ为研究对象,对其催化机制进行了研究。利用同位素标记法,结合1H-NMR,LC-MS等手段对酶反应产物L-PAC进行分析。根据我们得到的数据,我们认为其重要的反应中间体羟乙基硫胺素焦磷酸(HEThDP)除文献报道的烯铵结构和C2α-碳负离子结构之外,还存在第三种共振结构,即烯醇式结构。这与本课题组在研究另外一种ThDP依赖酶,1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶(DXS)催化机制时得到的结论相吻合。