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DNA是遗传信息的载体,其分子结构的完整性和稳定性对于调控生物体的正常生理活动起着重大作用。但由于细胞内外复杂的环境因素,核酸难免会受到一定程度的损伤。脱碱基位点(AP site)是一种常见的DNA损伤,即在链中产生脱氧核糖残基的无碱基位点。未及时修复的脱碱基位点容易导致基因突变甚至发生遗传疾病。因此,实现脱碱基位点的高灵敏检测和缺失碱基类型的准确鉴定不但可以实现相关疾病的早期筛查诊断,更有助于环境污染物的毒性评价以及致毒机理的研究。本论文主要包括两部分:第一部分综述了脱碱基位点的产生、修复及主要的检测方法。第二部分为研究内容。结合碱基剪切修复的基本过程,本工作将DNA修复酶参与的碱基修复和标记与电化学发光技术相结合,建立了一种普适性的电化学发光法检测脱碱基位点。该方法不但可以灵敏的定量碱基缺失位点,还可以准确鉴定缺失碱基的类型。主要包括以下两个部分:1.基于碱基修复和标记的电化学发光法检测双链DNA(dsDNA)中的脱碱基位点。在本研究工作中,首先在金电极上通过化学键合的方法构建了含有碱基缺失位点的dsDNA膜,并利用循环伏安法(CV)和计时库仑法(CC)对其进行定性与定量表征,测得电极上dsDNA膜的表面密度为3.80×10-12mol/cm2。在此基础上,引入特异性人源脱嘧啶/嘌呤核酸内切酶(APE1)识别并水解碱基缺失位点处的磷酸二酯键,造成DNA单链断裂;随后利用T4 DNA聚合酶将修饰有生物素的脱氧核苷酸(bio-d NTP)连接到DNA断裂处的3′羟基端,填补缺口;通过生物素与亲和素的特异性反应,将标记在链霉亲和素上的电化学发光分子三联吡啶钌衍生物Ru(bpy)32+连接到含有碱基缺失位点的DNA上;最后根据电化学发光信号的产生定量dsDNA膜中的脱碱基位点。在最优实验条件下,本方法可实现从480个正常碱基中检测到1个脱碱基位点,且结合DNA表面密度计算得到本方法可检测到0.25 f M个脱碱基位点。另一方面,研究发现在dsDNA中,当碱基缺失位点对面互补链中的碱基为腺嘌呤(A)时,只有bio-d UTP能成功连接到电极表面的DNA链上,产生增强的发光信号。且当脱碱基位点对面互补链中的碱基分别更换为胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)时,相应的只有连接bio-d ATP,bio-d CTP和bio-d GTP后才能产生增强的发光信号。其主要的原因是在DNA修复过程中,根据碱基互补配对的原则,连接到脱碱基位点处的碱基完全取决于对面互补链处的碱基类型。因此,可以根据连接到dsDNA上的bio-d NTP类型推断缺失碱基的类型,实现对AP位点缺失碱基类型的准确鉴定。基于此该方法还被成功应用于同一碱基缺失位点处两个不同缺失碱基的类型鉴定,有望实现同一碱基缺失位点处所有不同碱基的测定。与文献中报道的方法相比,本方法无需合成复杂、特殊的化学探针用于脱碱基位点的标记,为dsDNA中脱碱基位点的高灵敏检测以及缺失碱基的鉴定提供了一种简便、通用性的方法。2.环境污染物造成的碱基转变,可被特异性的DNA糖基化酶切除形成碱基缺失位点。对于那些难以直接测定的非正常的化学惰性的碱基反应产物,可以先利用相应的糖基化酶将其转化成碱基缺失位点,然后进行定量测定与碱基类型的鉴别。在本研究工作中,首先通过巯基自组装的方式在金电极表面固定含有特殊碱基-尿嘧啶(U)的dsDNA单分子层,引入特异性尿嘧啶糖基化酶(UDG),识别并切除dsDNA中的尿嘧啶。随后引入APE1和DNA聚合酶进行修复过程伴随的生物素标记,最后检测基于生物素和亲和素反应结合到电极上的信号分子产生的电化学发光信号。同时,还利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)实验验证了UDG作用下产生脱碱基位点。研究同样发现在dsDNA中,只有bio-d UTP能成功连接到电极表面的DNA链上,产生发光信号,以此可以判断发生改变的正常碱基类型。该方法在本论文第一个研究工作的基础上引入糖基化酶将特殊的碱基剪切转化为脱碱基位点,为DNA损伤的检测和损伤碱基类型的鉴定提供了一种新的方法。