论文部分内容阅读
目的:探讨脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导大鼠肝细胞胱硫醚γ-裂解酶-硫化氢(cystathionineγ-lysae-hydrogen sulfide，CSE-H2S)体系的规律性变化;查明CSE来源的H2S在LPS诱导的肝细胞凋亡中的作用，探讨内源性H2S参与肝细胞凋亡的相关机制。
方法:大鼠肝细胞系BRL细胞培养，用CSE siRNA应用于正常培养的BRL细胞、LPS处理的BRL细胞。用RT-PCR、Western blot检测CSE的基因和蛋白表达变化，用去蛋白法检测细胞内源性H2S生成量变化;生化方法检测细胞上清乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性、细胞丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量、细胞还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量以及MTT细胞生长抑制率变化;用流式细胞术、Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率变化;荧光显微镜检测线粒体膜电位(mitochondrialmembrane potential，MMP)变化;Western blot检测细胞色素C(CytochromeC，Cyt C)、caspase-3激活体蛋白(cleaved Caspase-3)表达变化。
结果:1、大鼠肝细胞系BRL细胞在正常培养条件下存在着CSE基因、蛋白表达以及内源性H2S生成;CSE siRNA引起BRL细胞CSE蛋白表达下调，内源性H2S生成明显减少;与Negative control组比较，CSEsiRNA转染BRL细胞4-24h，BRL细胞上清LDH活性、细胞MDA含量、细胞GSH含量、MTT细胞增殖活力及细胞凋亡率均无明显影响。2、随着LPS作用时间延长(0～24h)及LPS作用浓度(0.1～100μg/ml)升高，CSE基因、蛋白表达明显上调，内源性H2S生成呈时间依赖性和剂量依赖性明显增多;细胞凋亡比率上升，细胞MMP降低，胞浆Cyt C、caspase-3激活体蛋白表达上调;BRL细胞上清LDH活性增加，细胞MDA含量上升，细胞GSH含量在8h上调，12h、24h下降，MTT细胞生长抑制率在8h下调，12h、24h上升。3、CSE siRNA与LPS共同作用BRL细胞，与LPS单独作用组相比，BRL细胞凋亡率在4h上升，8h无显著性差异，12h、24h明显下降;细胞MMP在4h下降，8h无显著性差异，12h、24h明显上升;胞浆Cyt C、caspase-3激活体蛋白表达在4h上升，8h无显著性差异，12h、24h明显下降。
结论:1、大鼠肝细胞系BRL细胞在正常培养条件下存在着CSE基因、蛋白表达以及内源性H2S生成，内源性H2S对LPS诱导肝细胞凋具有调节作用，少量生成的H2S抑制细胞凋亡、多量生成的H2S促进细胞凋亡;2、细胞凋亡的线粒体途径参与介导了内源性H2S对肝细胞凋亡的调节效应。3、查明LPS诱导肝细胞CSE-H2S体系的规律性变化，初步揭示肝细胞CSE-H2S体系可能存在着的凋亡调节作用。