弓形虫是一种专性细胞内寄生的寄生虫,宿主范围广泛,可寄生于哺乳动物、鸟类及一些冷血动物,呈世界范围内流行,全球约有10亿人感染,我国人群感染率为7.88%。畜禽血清阳性率很高,猪弓形虫阳性率高达30.16%,弓形虫感染严重影响了人的健康和畜牧业的发展。弓形虫是一种机会致病原虫,人感染后多数无明显特异性症状表现,但急性感染发生于孕妇、初生儿或免疫抑制患者就会产生严重的后果,因此对弓形虫病的早期诊断和尽早治疗具有重要意义。弓形虫循环抗原(circulating antigen,CAg)是弓形虫感染过程中出现最早的特异性标志物,通过检测血清弓形虫循环抗原可以实现对弓形虫急性感染的早期或活动期的检测,本研究建立了双抗体夹心ABC-ELISA和胶体金免疫层析试纸条两种方法,来检测弓形虫循环抗原,以实现弓形虫感染的早期诊断,对目前通过抗体检测弓形虫的方法是一种有效的补充。试验1 抗CAg单抗的制备及抗ESA多抗的制备弓形虫循环抗原(CAg)是弓形虫早期感染的重要指标,制备抗CAg的高特异性抗体,对于建立弓形虫感染的早期诊断方法具有重要意义。制备了弓形虫排泄分泌抗原(excretory-secretory antigens,ESA),并将其免疫动物,融合后的杂交瘤细胞先通过两种ESA抗原的筛选,再经含CAg的阳性血清筛选,以获得特异性针对CAg的单抗,并对所获单抗的性质进行鉴定。结果表明,获得了 3A5、3E5和10F5-3三株单抗,其效价分别为1:64000、1:32000、1:32000,三株单抗分别针对不同的抗原表位,免疫荧光定位显示三株抗体均与弓形虫反应,表明获得的三株单抗对弓形虫CAg都有较高的特异性,均可应用于对弓形虫感染早期或活动期的诊断。试验2双抗夹心ABC-ELISA方法的建立为检测弓形虫循环抗原,以实现弓形虫急性感染的早期诊断,建立了基于ABC(avidin biotin-peroxidase complex)放大系统的双抗体夹心ELISA方法。以方阵滴定法确定多抗最佳包被量和单抗工作浓度,利用夹心法和ABC放大系统建立了检测弓形虫循环抗原的夹心ABC-ELISA方法,用该方法对人工感染犬和阳性感染血清进行检测以确定该方法的检出时间和准确性,并应用于临床样本的检测。结果表明,双抗体夹心ELISA反应条件:兔多抗包被浓度为3.7μg/mL,生物素标记3A5、3E5和10F5-3单抗在混合工作液中的浓度分别为0.1 μg/mL、0.13 μg/mL、0.12 μg/mL,酶标生物素和链酶亲和素以2:3体积比混合成ABC复合物。该ELISA方法的对ESA最低检测限为11.9 ng/mL,并与隐孢子虫早期感染牛血清、血吸虫尾蚴早期感染牛血清、艾美耳球虫早期感染鸡血清、犬瘟热急性感染早期血清、犬细小急性感染血清无交叉反应。用该ELISA方法检测人工感染的犬,于感染后2d血清即显示阳性,本方法能明显区分标准阳性血清和阴性血清。68份猪临床血样(混入2份标准阳性血清)用该方法和Nest PCR同时检测结果一致。表明该双抗体夹心ABC-ELISA方法特异性强、灵敏性高,可用于弓形虫急性感染的早期、或活动期的快速诊断。试验3胶体金免疫层析试纸条的研制为建立一种简易、快速的胶体金免疫层析法(colloidal gold immuno chromatography test,ICT)用于检测血清中弓形虫循环抗原(CAg)。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,用胶体金颗粒标记抗CAg单克隆抗体,抗ESA兔多抗喷涂于NC膜,建立了基于双抗夹心法的免疫层析检测方法,血清中的弓形虫循环抗原与金标记单克隆抗体结合后沿着硝酸纤维素膜移动,与膜上的固相多克隆抗体结合形成肉眼可见的红色线条。用该方法对感染后不同时间犬阳性血清进行检测,并对已知弓形虫感染阴性和阳性血清进行检测以确定其准确性,与双抗体夹心ABC-ELISA进行比较。结果表明,使用该试纸条检测弓形虫感染犬血清,感染后2～7 d的血清均为阳性,表明该方法适用于弓形虫感染的早期诊断,并与隐孢子虫早期感染牛血清、血吸虫尾蚴早期感染牛血清、艾美耳球虫早期感染鸡血清、犬瘟热急性感染早期血清、犬细小急性感染无交叉反应,与弓形虫ELISA检测结果的符合率为100%。表明该免疫层析试纸条具有较高的特异性和准确性,并且方法简便快速,有广泛的应用价值。