研究背景氯胺酮(ketamine)是苯环己哌啶(N-1-phenycyclohexy-piperidine,PCP)的衍生物,属N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体拮抗剂,临床用于手术麻醉。氯胺酮俗称“K粉”,上一世纪70年代初首先在美国发生流行性滥用,20世纪90年代以来,随着全球范围日益严重的“舞会药”(party drug)滥用,氯胺酮滥用很快蔓延至亚洲地区并波及至中国大陆,常被滥用于娱乐场所,是目前较为流行的新型毒品之一。我国对氯胺酮制剂一直采取严密的管制措施,氯胺酮1996年被列入国家基本药物,由于近年来日益严重的滥用问题,氯胺酮于2002年被列入二类精神药品管制,2005年1月又被列入一类精神药品管制。药物依赖涉及CNS复杂的神经机制及中枢内众多的神经核团。到目前为止,药物依赖的形成机制一直未能明确。氯胺酮作为NMDA受体拮抗剂,可非竞争性抑制NMDA受体的活性。由于谷氨酸与NMDA受体在药物依赖的形成和发展过程中起着重要作用,NMDA受体拮抗剂被认为可抑制药物成瘾的依赖症状。因此,氯胺酮可通过拮抗NMDA受体而抑制成瘾性药物的依赖性形成和戒断反应。动物实验表明氯胺酮可抑制吗啡依赖大、小鼠的催促戒断症状,临床上也有使用氯胺酮治疗阿片成瘾者戒断症状的报道。但流行病学调查及吸毒者心理状况分析的结果表明,氯胺酮与其他精神兴奋性物质,如甲基苯丙胺合并使用后,可明显增强了病人对成瘾性物质的渴求和精神依赖。在我们已完成的国家自然科学基金项目中,氯胺酮原设计作为抑制NMDA受体的阳性对照药,与中药有效成分的抗NMDA受体作用进行对照。我们的研究发现,氯胺酮和甲基苯丙胺单独使用、或两药合用均可使小鼠产生条件性位置偏爱(CPP),而氯胺酮与甲基苯丙胺联合引起的CPP效应的维持时间比两药单独使用导致的CPP明显延长。氯胺酮还能明显增强苯丙胺的中枢兴奋性。我们首先在动物模型上证明了氯胺酮具有很强的精神依赖性潜力。国内外的相关报道与我们的研究结果基本一致。研究目的在成熟的中枢神经系统突触后致密体(PSD)中,NMDA受体和AMPA受体存在大量共定位现象,即NMDA受体和AMPA受体共存于同一突触。两种受体亚单位在突触中组合成特定的共定位簇,这种共定位的关系随着神经细胞的发育的不同阶段而呈现异质性,相对于NMDA受体的稳定,突触后膜上的AMPA受体的状态和数目是高度可变的,这种变化对于调节突触传递效能起着十分重要的作用。近年来相关的研究表明,在依赖性药物作用下中脑边缘多巴胺系统及相关脑区神经元上AMPA受体的功能或数量早期即发生了一系列的变化,从而进一步介导了许多后续效应的发生与维持,AMPA受体的改变可能是触发药物依赖的“扳机”。总之,在药物成瘾方面,NMDA受体和AMPA受体的之间的关系是紧密联系又互为影响的,单独研究一方面而忽略另一方面都是不可取的。本课题研究在离体环境下,氯胺酮造成的成瘾性神经元样PC12细胞中,NMDA受体和AMPA受体的表达情况,并使用中药钩藤中的主要有效成分钩藤碱进行干预,探索氯胺酮的成瘾机制和中药钩藤临床抗药物成瘾的机理。实验方法和结果1.神经元样细胞模型的建立:PC12 CELLS鼠嗜咯细胞瘤细胞系(PC12 ratpheochromocytoma cells,PC12 cells),是一种从鼠嗜铬细胞瘤分离的克隆细胞,因其在神经生长因子(NGF)存在下,细胞在形态、结构和功能皆类似于交感神经细胞,因而成为近年来神经科学工作者研究神经细胞递质合成、储存和释放、离子通道及受体的细胞模型。PC12细胞含有T、L、N型钙通道及NMDA受体,PC12细胞的NMDA受体与海马神经元上的一致,并且PC12细胞在分化前后都表达AMPA受体二型亚单位GluR2的mRNA(GIuR-B flip mRNA)。相对于原代培养的神经元细胞,PC12 cells易于获取,在培养中贴壁率高,繁殖速度快,传代稳定。本课题选用PC12 cells,通过NGF的刺激诱导,使PC12细胞成功的分化为神经元样细胞,不仅符合神经元细胞的各种形态特征,而且通过免疫组化法成功的检测出了NMDA和AMPA受体的表达,建立了合适的细胞模型。2.氯胺酮和钩藤碱的细胞毒实验:阿片类,苯丙胺类导致离体的神经细胞成瘾的作用时间约为48小时左右。时间太短无法建立起成瘾模型,太长又因本身的细胞毒作用导致神经细胞的衰亡。我们实验设计氯胺酮导致细胞成瘾的时间为48小时,通过施加不同剂量的氯胺酮在神经性PC12细胞上,考察药物对细胞的损伤程度,同时对比不同剂量组的钩藤碱,用MTT法测定氯胺酮和钩藤碱对细胞活力的影响。从实验结果我们可以看出:持续用药48小时后,PC12 Cells的细胞活力随着氯胺酮浓度的不断升高而呈现下降的趋势,当氯胺酮浓度大于1mmol/L的时候,细胞活力开始降低。1.5mmol/L和2.0mmol/L浓度组和对照组相比有显著差异(P＜0.01),说明氯胺酮的最大安全剂量为1mmol/L.和氯胺酮处理组相比,施加不同剂量钩藤碱处理后各组中的细胞活力均和正常对照无显著差异,钩藤碱在0.25～1.00 mmol/L范围内对PC12 Cells都是安全的。3.免疫荧光法测定PC12细胞上NMDA受体和AMPA受体的表达:免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理,先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物,再用这种荧光抗体(或抗原)作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。本实验通过免疫荧光技术检测氯胺酮对神经元样PC12细胞上NMDA受体NR1亚单位和AMPA受体亚单位GluR2/3蛋白表达的影响,分析NMDA受体和AMPA受体在氯胺酮成瘾中起到的作用,并用中药成分钩藤碱进行干预,探讨钩藤碱抗成瘾机制。按药物对细胞的不同处理方法分为八个组:空白对照(Control)一组,氯胺酮一个组,钩藤碱三组,钩藤碱和氯胺酮合并处理三组。接种于96孔板中PC12细胞用NGF诱导分化成熟后,吸净陪养基,PBS液洗孔后加入基础培养基(CONTROL)一组,Ketamine(终浓度为1mmol/L)一组,Rhy三组(终浓度分别为0.25mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L),合并用药的三个组提前加入钩藤碱,孵箱中孵育15分钟后再加入氯胺酮(Rhy各组终浓度分别为0.25mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L;Ketamine终浓度为1mmol/L),全板共八组,每组加药10孔。加药完毕后将96孔板置于孵箱中培育(恒温37℃,5%CO2)48小时。48小时后进行免疫荧光染色,在荧光显微镜下观察和采集图象,用Image-Pro Plus 6.0进行分析,统计每个视野阳性区的平均光密度(MeanDensity)值。值越高则说明NR1和GluR2/3蛋白的表达越强烈。从实验结果可以看出:①在AMPA受体方面,对细胞施加了1mmol/L的KETA后GluR2/3蛋白的表达和正常对照组存在显著差异(P＜0.01),表达明显增强。RHY的0.25,0.50,1.00 mmol/L的低中高三个剂量组中GluR2/3蛋白表达均和正常组无显著差异。合并用药的三个组中RHY 1mmol/L+KETA 1mmol/L组中GluR2/3蛋白表达和正常组有显著差异(P＜0.01),表达增强;而其他两个组均和正常组无显著差异。②在NMDA受体方面,八个处理组中除了RHY 1mmol/L组和正常组有显著差异(P＜0.05)外其他七组均无差异。③对比AMPA受体亚单位GluR2/3和NMDA受体亚单位NR1,可以看出除了1mmol/L的KETA组,其他各处理组中NR1蛋白的表达水平总体在GluR2/3之上,而1mmol/L的氯胺酮显著上调了GluR2/3蛋白的表达,甚至超过了NR1蛋白的表达水平。结论1.验证了神经元样PC12细胞做为研究谷氨酸受体的平台,是一种非常有效的研究工具。2.考察了氯胺酮对细胞成瘾的合理剂量范围,并在细胞毒性方面对钩滕碱的安全性做出了评估,表明钩藤碱是一种非常安全的成分。3.揭示了AMPA受体在氯胺同酮成瘾机制中起到了非常关键的作用,而钩藤碱的抗成瘾作用也是通过影响AMPA受体来体现的。讨论通过研究我们提出一种设想,氯胺酮的“选择性抑制”和钩藤碱的“占用效应”理论来解释:在一定条件下,氯胺酮只抑制突触后膜的NMDA受体(我们推测这种受体一定是和AMPA受体的共定位受体簇,比如NR1-GluR2/3的共定位簇),可以表现出对阿片类,苯并胺类的抗成瘾作用。但当药物刺激超过一定程度(例如时间和剂量等),细胞内休眠的AMPAR被再次激活,产生一种动态分布效应,AMPA受体不断被锚定到突触后膜上,又通过胞引作用进入到细胞内,使细胞间产生一种链式反应,这种反应导致所谓的“静寂突触”的激活(突触后膜上只有NMDA受体,而没有功能性AMPA受体的突触),即NMDA受体通过所“征募”到的AMPA受体而被“唤醒”,极有可能形成新的NMDAR-AMPAR的共定位受体簇。这样,氯胺酮的成瘾性表现出来。为什么氯胺酮和钩藤碱同为NMDA受体的非竞争性拮抗剂,但钩藤碱却无成瘾性和致幻作用呢?这是因为钩藤碱在占据NMDA受体位点时的非选择性,钩藤碱攻击这些结合位点的时候,不像氯胺酮那样只占据和刺激与AMPA受体形成共定位簇的NMDA位点,而是只要表现出NMDA受体特征的任何位点全部占据,包括“静寂突触”上的结合位点(这可能是钩藤碱下调了NR1蛋白的表达的原因之一),所以当这些位点全被占满以后,一方面导致细胞内休眠的AMPA受体无法通过刺激这些共定位簇的位点而复苏(这解释了为什么单独使用钩藤碱并不上调GluR2/3蛋白的表达),另一方面即便有自由的AMPA受体却也找不到多余的可供结合的NMDA受体位点,氯胺酮也就无法通过激活AMPA受体来活化NMDA受体的除极化反应,一系列的神经传导信号被阻断,这就是钩藤碱对氯胺酮的干预机制和其抗成瘾机理总之,氯胺酮的成瘾性和NMDA和AMPA受体间的交互作用有着极大的关系,成瘾后导致的AMPA/NMDA比值的偏移并不能简单的定义为绝对的升高或降低,但仍然可以看出AMPA受体在氯胺酮的成瘾过程中发挥了关键性的作用,中药成分钩藤碱的抗成瘾作用也是通过NMDA-AMPA受体通路的复杂调控来实现的。至于氯胺酮具体是通过一种什么样的途径来影响AMPA受体,氯胺酮和钩藤碱在分子构型上对NMDA受体和AMPA结合位点的作用有何差异,则有待进一步深入研究。注:本论文中的所有数据均采用SPSS 13.0进行分析。多组间比较采用单向方差分析(One-way ANOVA),各组均数的多重比较采用最小显著差值法(leastsignificant different,LSD);不满足方差齐性要求是,采用Dunnett’s T3法。