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目的:本项目拟制备壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米粒(CS/CMCS-NPs)负载多西环素(Dox)后形成的复合纳米粒体系(Dox:CS/CMCS-NPs),研究其理化性质、细胞相容性和抗菌性能;构建人牙龈成纤维细胞(HGFs)中由牙龈卟啉单胞菌脂多糖(P.gingivalis-LPS)和三磷酸腺苷(ATP)联合诱导而出的NLRP3炎症小体模型,研究Dox:CS/CMCS-NPs复合纳米粒体系对人牙龈成纤维细胞中NLRP3炎症小体的抑制作用。方法:1.人牙龈成纤维细胞原代培养、鉴定及NLRP3炎症小体模型的构建与抑制:组织块培养法培养原代人牙龈成纤维细胞,采用免疫荧光法对其进行鉴定;用牙龈卟啉单胞菌脂多糖联合三磷酸腺苷诱导人牙龈成纤维细胞构建NLRP3炎症小体模型,并用多西环素调控细胞模型,实时荧光定量聚合酶链式反应法、酶联免疫吸附法及蛋白质印迹法检测其相关mRNA及蛋白的表达量。2.包载多西环素的复合纳米粒体系Dox:CS/CMCS-NPs及不包载多西环素的纳米粒CS/CMCS-NPs的制备及性质检测:采用离子交联法制备Dox:CS/CMCSNPs及CS/CMCS-NPs复合纳米粒体系;采用扫描电镜及透射电镜观察其形态;激光纳米粒度仪测定其粒径及分散度;分光光度计测定Dox:CS/CMCS-NPs的载药量及包封率。3.CS/CMCS-NPs及Dox:CS/CMCS-NPs复合纳米粒体系的细胞相容性及抑菌性检测:采用CCK-8试剂盒,测定CS/CMCS-NPs及Dox:CS/CMCS-NPs复合纳米粒体系在0μg/ml、62.5μg/ml、125μg/ml、250μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml浓度下,分别作用于人牙龈成纤维细胞24、48、72小时的细胞活性;菌落计数法测定Dox:CS/CMCS-NPs复合纳米粒体系对牙龈卟啉单胞菌的抑菌性。4.Dox:CS/CMCS-NPs复合纳米粒体系对人牙龈成纤维细胞中NLRP3炎症小体的作用:分别用多西环素、包载多西环素的复合纳米粒体系Dox:CS/CMCS-NPs及不包载多西环素的纳米粒CS/CMCS-NPs刺激人牙龈成纤维细胞NLRP3炎症小体模型,通过实时荧光定量聚合酶链式反应法、酶联免疫吸附法及蛋白质印迹法检测其相关mRNA及蛋白的表达量。结果:1.人牙龈成纤维细胞原代培养、鉴定及NLRP3炎症小体模型的构建与抑制:免疫荧光结果显示,细胞为牙龈来源的成纤维细胞;实时荧光定量聚合酶链式反应法及蛋白质印迹法结果显示,NLRP3炎症小体相关mRNA及蛋白(NLRP3,ASC,Caspase-1,IL-1β)在LPS+ATP刺激后表达量均上调,经多西环素刺激后表达量均下调,与空白组比较均有统计学差异。2.包载多西环素的复合纳米粒体系Dox:CS/CMCS-NPs及不包载多西环素的纳米粒CS/CMCS-NPs的制备及性质检测:(1)CS/CMCS-NPs与Dox:CS/CMCS-NPs复合纳米粒体系均形貌规整、结构稳定;(2)Dox:CS/CMCS-NPs的载药量为28±4.01,包封率为75±7.21。3.Dox:CS/CMCS-NPs复合纳米粒体系的细胞相容性及抑菌性检测:CCK-8结果显示,Dox:CS/CMCS-NPs复合纳米粒体系在0μg/ml、62.5μg/ml、125μg/ml、250μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml浓度下,对人牙龈成纤维细胞作用24、48、72小时的细胞活性与空白组无统计学差异;菌落计数结果显示,Dox:CS/CMCS-NPs比CS/CMCS-NPs及空白组能更有效的抑制牙龈卟啉单胞菌的生长。4.Dox:CS/CMCS-NPs复合纳米粒体系对人牙龈成纤维细胞中NLRP3炎症小体的作用:实时荧光定量聚合酶链式反应法及蛋白质印迹法结果显示,加入Dox:CS/CMCS-NPs复合纳米粒体系后,NLRP3炎症小体相关mRNA及蛋白(NLRP3,ASC,Caspase-1,IL-1β)的表达量均下调,与空白组及单纯刺激组比较,结果均有统计学差异。结论:1.Dox:CS/CMCS-NPs复合纳米粒体系性质稳定,具有良好的细胞相容性和抑菌性,是一种良好的载药纳米粒。2.牙龈卟啉单胞菌脂多糖联合三磷酸腺苷可以激活人牙龈成纤维细胞中的NLRP3炎症小体通路,多西环素及Dox:CS/CMCS-NPs复合纳米粒体系可以下调其表达。