论文部分内容阅读
研究背景与目的动脉粥样硬化(therosclerosis,AS)是多种心血管疾病的发病基础,斑块的形成是动脉粥样硬化的标志性病变,而不稳定斑块的破裂及由此引起的血栓形成,从而导致的急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome,ACS),是世界上致死率及致残率的主要病因。斑块破裂的脆弱性是动脉粥样硬化的关键风险因子,降低斑块脆弱(不稳定)性是一种有效的心血管风险预防策略。动脉粥样硬化不稳定斑块的形成有多种因素参与,炎性反应、脂代谢紊乱等贯穿于不稳定斑块形成与破裂的全过程。炎性反应加剧了动脉粥样硬化斑块的恶化,使脆弱的动脉粥样硬化斑块易于破裂。研究发现自噬可抑制异常炎性反应,进而增加斑块的稳定性。小檗碱(berberine,BBR)是从中药黄连中提取的主要有效成分,具有多方面的药理作用。现代药理研究发现,小檗碱可以防治动脉粥样硬化,但其对动脉粥样硬化不稳定斑块的作用及相关机制尚不明确。研究发现,糖尿病(高血糖)及高脂血症(血脂代谢异常)均可以引起动脉粥样硬化,而巨噬细胞作为炎性细胞在动脉粥样硬化过程中起着关键作用,本研究以ApoE-/-小鼠和人单核细胞系Thp1为研究对象建立糖尿病及高脂血症诱导的动脉粥样硬化模型和炎性反应模型,来考察小檗碱对动脉粥样硬化不稳定斑块的作用,并以炎性反应及自噬作为切入点探索小檗碱的作用机制。研究方法将8周龄的雄性ApoE-/-小鼠随机分为对照组(control)、糖尿病组[hyperglycemia,腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ),剂量45mg/(kg.d),连续5d]和高脂血症组(hyperlipidemia,高脂饮食,HFD);造模2周后糖尿病组随机取10只小鼠组成小檗碱预防组[灌胃,BBR50mg/(kg·d)];造模4周后,糖尿病组随机分为模型(STZ)组(灌胃,溶剂)、BBR25、50、100(STZ)组[灌胃,BBR 分别 25、50、100mg/(kg·d)]、阿托伐他汀组[灌胃,2.5mg/(kg·d)]、恩格列净组[灌胃,1.25mg/(kg·d)],高脂血症组随机分为模型(HFD)组(灌胃,溶剂)、BBR50(HFD)组[灌胃,50mg/(kg·d)];6周后,采用生化分析仪检测小鼠血清中血脂四项总胆固醇(Total Cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(Low Density Lipoprotein Cholesterol,LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(High Density Lipoprotein Cholesterol,HDL-C)的含量;采用ELISA方法(酶联免疫吸附法)检测血清中IL-1β的表达;取小鼠主动脉进行病理切片染色(HE、油红O、天狼猩红染色)及免疫组织学(α-SMA、MoMa-2、MIF、NLRP3检测,评估动脉粥样硬化病变情况及斑块脆弱性性指数;佛波酯(PMA)诱导Thp1细胞分化为巨噬细胞后,加入脂多糖(LPS)与胆固醇晶体刺激,并用不同浓度的小檗碱(5,10,20μmol/L)处理24小时,研究小檗碱对自噬和炎性反应信号通路的影响;采用ELISA方法检测细胞上清液中IL-1β的水平,采用Western Blot方法检测小鼠主动脉及细胞中MIF、NLRP3、AMPK/mTOR信号通路及自噬相关蛋白的表达。研究结果糖尿病小鼠血糖显着升高(P<0.001)并持续高血糖(血糖≥20mmol/L),糖耐量明显降低(P<0.01);糖尿病和高脂血症小鼠血清脂质水平(TC和LDL-C)显着升高(P<0.01);主动脉根部横切面HE染色AS斑块面积显著增大(P<0.01),主动脉大体油红O染色面积显著增大(P<0.01),动脉粥样硬化病变明显恶化;斑块脂质含量(油红O%)、巨噬细胞含量(MoMa-2%)显着升高(P<0.01),胶原含量(Sirius深红染色%)、平滑肌细胞含量(α-SMA%)显着降低(P<0.01),脆弱性指数明显升高(P<0.01),斑块稳定性明显降低;炎性反应上调(NLRP3及IL-1β上调),自噬受损(LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比率下调、SQSTM1/P62上调),MIF表达上调。BBR治疗后,糖尿病小鼠血糖和糖耐量无明显改善,但小檗碱预防组[pre-BBR50(STZ)]在治疗后期(11周～13周)血糖显着降低(P<0.05)、糖耐量明显改善(P<0.01);糖尿病和高脂血症小鼠血清脂质水平(TC和LDL-C)显着降低(P<0.05);斑块面积与油红O染色面积均显著减小(P<0.05),动脉粥样硬化病变得到明显改善;斑块脂质含量、巨噬细胞含量显着降低(P<0.05),胶原含量、平滑肌细胞含量显着升高(P<0.05),脆弱性指数明显降低(P<0.05),斑块稳定性明显升高;炎性反应减轻(NLRP3及IL-1β下调),自噬改善(LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比率上调、QSTM1/P62下调);MIF表达下调。Thp1细胞经佛波酯(PMA)诱导分化为巨噬细胞、脂多糖(LPS)与胆固醇晶体刺激、BBR处理24小时后,炎性反应下调(NLRP3及IL-1β下调),自噬改善(LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比率上调、QSTM1/P62下调),p-AMPK/AMPK的比率上调,AMPK活化被诱导,p-mTOR/mTOR 比率下调;MIF表达下调,SP1磷酸化被抑制(p-SP1/SP1比率下调)。结论小檗碱能够使糖尿病和高脂血症ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块沉积和斑块脆弱性得到改善;其机制可能与下调MIF的蛋白表达,以及通过AMPK/mTOR信号通路促进巨噬细胞自噬进而抑制炎性反应有关。