【摘 要】
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目的呼吸道感染（RTI）是世界范围内的常见病、多发病。不同病原体引起的呼吸道感染的临床症状非常相似,常常呈现出“一病多因”的状况。常规实验室检测手段有限,无法满足同时检测多种病原体的需求。本研究旨在建立一种能够快速、准确、同时检测临床上常见的十二种呼吸道病原体的多重实时荧光定量PCR检测方法,包括新型冠状病毒（SARS-Co V-2）、腺病毒（ADV）、甲型流感病毒（Flu A）、乙型流感病毒（F
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目的呼吸道感染（RTI）是世界范围内的常见病、多发病。不同病原体引起的呼吸道感染的临床症状非常相似,常常呈现出“一病多因”的状况。常规实验室检测手段有限,无法满足同时检测多种病原体的需求。本研究旨在建立一种能够快速、准确、同时检测临床上常见的十二种呼吸道病原体的多重实时荧光定量PCR检测方法,包括新型冠状病毒（SARS-Co V-2）、腺病毒（ADV）、甲型流感病毒（Flu A）、乙型流感病毒（Flu B）、呼吸道合胞病毒（RSV）、副流感病毒1型（PIV1）、副流感病毒2型（PIV2）、副流感病毒3型（PIV3）、嗜肺军团菌（LP）、肺炎支原体（MP）、肺炎衣原体（CP）、肺炎链球菌（SP）,为临床呼吸道感染常见病原体的检测提供一种新的方法。方法1、根据文献调研选择SARS-Co V-2、Flu A、Flu B、ADV、RSV、PIV1、PIV2、PIV3、LP、MP、CP、和SP的基因组的高度保守区作为靶基因,针对高度保守区设计引物和探针。2、选择12呼吸道病原体及核糖核酸酶P（RNase P）的两引物之间的基因片段作为研究目的序列,合成带有目的序列的重组质粒标准品作为各病原体的阳性参考品。3、以制备的重组质粒标准品为模板,优化引物探针浓度和退火温度,建立12种呼吸道病原体多重实时荧光定量PCR检测方法。以10~3～10~7 copies/m L重组质粒标准品利用所建立的体系进行扩增,绘制标准曲线。4、选取三种不同浓度的重组质粒标准品混合物为模板,进行组间和组内重复性试验,验证该检测方法的重复性。以SARS-Co V-2、Flu A、Flu B、ADV、RSV、PIV1、PIV2、PIV3、SP、LP的真实样本核酸和MP、CP的重组质粒标准品为模板,验证该检测方法的特异性。5、用数字PCR对SARS-Co V-2、Flu A、Flu B、ADV、RSV、PIV1、PIV2、PIV3、SP、LP的真实样本核酸和MP、CP的重组质粒标准品进行定量后,选取1000 copies/m L、500 copies/m L、250 copies/m L和100 copies/m L四种不同浓度的模板,验证该检测方法的灵敏度。结果1、成功建立了SARS-Co V-2、ADV、LP与Flu A、RSV、Flu B与PIV1、PIV2、PIV3与MP、CP、SP的4种多重实时荧光定量PCR检测体系。各体系在10~3～10~7copies/m L重组质粒标准品下与Ct表现出良好的线性关系。2、以三种不同浓度的重组质粒标准品混合物为模板进行检测时组内和组间重复试验的变异系数均在3%以内,重复性好。3、各检测体系内的引物探针只和对应样本呈阳性结果,而对其他模板无扩增,特异性较强。4、该检测方法对SARS-Co V-2、ADV、Flu A、Flu B、RSV、PIV1、PIV2、PIV3、LP、MP、CP、SP的最低检测浓度都可达到500 copies/m L。结论本研究建立了一种能够同时检测12种呼吸道病原体的多重实时荧光定量PCR检测方法,经过初步验证该检测方法具有良好的重复性、特异性和灵敏度,具有临床推广价值,也可为突发传染病快速筛查病原体提供一种高通量、高效率的筛查手段。
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