背景:氧化铁纳米颗粒因独特的物理化学性能和优异的磁学特性,已被广泛应用于药物递送、核磁成像和疾病诊断。目前已有少量氧化铁纳米药物被美国食品药品监督管理局批准上市并进入临床应用,具体包括核磁成像造影对比剂（Feridex IV和Resovist）、静脉补铁剂（Ferumoxytol）、磁滞热疗药物（Cell Search）等。而静脉注射的氧化铁纳米颗粒主要聚集在肝脏和脾脏,且因结合血清蛋白质形成“纳米蛋白冠”,极易通过单核-吞噬细胞系统（Mononuclear phagocytic system,MPS）经C3补体-受体途径被巨噬细胞吞噬和清除。同时,MPS参与体内衰老或者损伤红细胞的清除过程,主要涉及正常生理条件下,脾脏红髓巨噬细胞对衰老的红细胞清除过程;及某些疾病如镰刀型细胞贫血病或疟疾感染状况下,肝脏枯否细胞对应激损伤红细胞的清除。研究者们发现,若采用静脉输注给予小鼠低剂量（1.25 mg/kg）同种异体抗红细胞抗体,可引起机体红细胞被MPS快速清除,造成MPS过度“消耗”,从而使纳米药物血液循环半衰期增加至原来的32倍。而考虑到纳米药物在临床上优越的应用前景,纳米药物进入体内后是否会影响MPS后续对红细胞的清除和代谢,目前还未有明确报道。在给予如纳米铁造影剂进行核磁成像、缺铁性贫血病人进行补铁时,即机体暴露于铁基纳米药物的情况下,是否会造成机体“铁过载”呢?进一步,因为MPS将最有可能承担铁基纳米材料体内循环利用及清除代谢任务;那么,体内纳米铁对MPS的“消耗”是否会延缓输入的红细胞的体内循环时间,降低其清除速度呢?另外,我们的前期研究表明,受血小鼠输注储存终末期的红细胞,其在体内更会被快速清除,那么该现象是否也会发生在输注储存红细胞的受血者体内,而且表现更为显著呢?从而对受血者输注红细胞有效性产生一定影响呢?同时“铁过载”造成MPS过度“消耗”状态可能具有一定时效性,随铁剂累积和时间延长,血液循环内部分单核细胞是否分化为巨噬细胞进行补充,行使吞噬、清除红细胞功能?而这对铁基纳米药物的相关临床研究,如造成“铁过载”后,对红细胞输注后在受血者体内的清除代谢规律具有重要意义。因此,本研究将首先构建骨髓来源巨噬细胞（Bone marrow-derived macrophage,BMDM）“铁过载”细胞模型,考察四氧化三铁纳米颗粒（Fe3O4-nanoparticles,Fe3O4-NPs）处理后的BMDM对新鲜和储存终末期RBCs吞噬功能是否发生变化,观察高剂量下Fe3O4-NPs是否造成BMDM“铁死亡”,并进一步探讨上述现象的可能机制;其次,考察Fe3O4-NPs预暴露造成的“铁过载”对体内输注红细胞后其清除规律的影响,进行体内、外实验现象的验证。目的:通过体内、外实验探讨纳米氧化铁造成的铁过载对红细胞输注后的清除规律的影响,为铁基纳米药物临床研究提供基础性科学数据;阐明相关机制,并明晰Fe3O4-NPs抑制巨噬细胞吞噬红细胞原因,为铁基纳米颗粒可能的临床应用及适应症提供科学数据及合理化建议。方法和结果:（1）Fe3O4-NPs的表征及巨噬细胞对其的摄入。通过Nano Brook Omni（Brookhaven）和透射电子显微镜测定其流体力学直径、Zeta电位以及粒径形貌特征等;综合物性测量系统（Quantum Design MMPS-9）测得其饱和磁化强度等磁学性能;傅立叶红外光谱仪表征Fe3O4-NPs是否成功进行羧基化修饰。透射电子显微镜和流式细胞仪测定BMDM对Fe3O4-NPs的摄入。结果显示:Fe3O4-NPs被成功羧基化修饰,表现良好的铁磁性,具有较低的矫顽力;Zeta电位为（-35.6±1.9）m V,呈负电性,电镜观测显示其平均粒径为（47.0±2.6）nm,水合动力学粒径为（133.0±5.2）nm。流式细胞术分析和透射电子显微镜（Transmission electron microscope,TEM）观测均表明,Fe3O4-NPs被巨噬细胞大量摄入,且呈“链索状”分布于细胞内部的囊泡内。（2）Fe3O4-NPs引起BMDM“铁过载”细胞模型的建立。通过活/死细胞染色法、Annexin V-FITC/PI凋亡与坏死检测试剂盒及胞内总活性氧含量流式分析以及细胞毒性测定（MTT法）来探究不同浓度（0、12.5、25、50、100μg/ml）Fe3O4-NPs对BMDM存活率的影响;通过细胞普鲁士蓝染色、钙黄绿素法检测BMDM内铁含量的动态变化及荧光定量PCR法检测“铁代谢”相关基因m RNA水平表达情况,以期筛选出不明显改变细胞存活率条件下引起BMDM“铁过载”适宜Fe3O4浓度。结果显示,当Fe3O4-NPs孵育浓度低于25μg/ml对细胞存活率无明显影响;而当其高于50μg/ml时,细胞存活率降低,胞内活性氧含量增加,差异具有统计学意义（P＜0.05）。25μg/ml Fe3O4-NPs处理BMDM内铁含量明显增加,差异具有统计学意义（P＜0.05）,同时细胞内“铁代谢”相关基因m RNA表达下调,如转铁蛋白（Transferrin）、转铁蛋白受体（Transferrin receptor,TFR-1）、核转录受体因子4（Nuclear receptor coactivator 4,NCOA4）等,表示BMDM处于“铁过载”状态。最终确定体外BMDM“铁过载”细胞模型Fe3O4-NPs处理浓度为:25μg/ml。（3）Fe3O4-NPs预处理引起巨噬细胞“铁过载”抑制其对RBCs吞噬功能。经25μg/ml Fe3O4-NPs处理BMDM 24 h后,按照RBCs:BMDM=50:1和100:1的比例,与RBCs共孵育12 h后,通过荧光共聚焦显微镜观测、游离血红蛋白检测和流式细胞术检测巨噬细胞对RBCs吞噬数量变化。结果显示与BMDM直接孵育RBCs组相比,经25μg/ml Fe3O4-NPs处理的BMDM对新鲜和储存终末期RBCs的吞噬量均发生明显下降。（4）高剂量Fe3O4-NPs诱发巨噬细胞“铁死亡”。采用流式细胞术、荧光共聚焦显微镜、透射电子显微镜以及荧光定量PCR法测定经50μg/ml和100μg/ml Fe3O4-NPs处理组BMDM与“铁死亡”相关指标:胞内活性氧和脂质过氧化物、线粒体形态、铁死亡相关基因:前列腺素内过氧化物合酶2（Prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2）、溶质载体家族7（Solute carrier family 7,SLC7A11）和谷胱甘肽过氧化物酶4（Glutathione peroxidase 4,GPX4）表达变化。结果显示上述高剂量Fe3O4-NPs诱发BMDM“铁死亡”,且该“铁死亡”过程是铁离子依赖性的,可被铁离子螯合剂---去铁胺（Deferoxamine,DFO）抑制。（5）巨噬细胞“铁过载”抑制其对RBCs清除的机制研究。使用流式细胞术检测清道夫受体抑制剂（Polyinosinic Acid,PIA）对Fe3O4-NPs的吞噬行为进行抑制,判断BMDM噬红功能降低是否由Fe3O4-NPs引起;通过使用不同浓度（50、100、200μm/ml）DFO预处理BMDM,或使用相同粒径、相同数目、相同表面修饰基团的聚苯乙烯微球（Polystyrene nanoparticles,PS-NPs）替代Fe3O4-NPs处理BMDM,并通过荧光共聚焦显微镜和流式细胞术测定不同处理条件的BMDM对新鲜和储存GFP-RBCs的吞噬数量是否发生改变。结果显示,PIA预处理的25μg/ml Fe3O4-NPs暴露组BMDM的普鲁士蓝染色照片未出现蓝色沉积,即BMDM对Fe3O4-NPs的吞噬受到抑制,且其对新鲜和储存GFP-RBCs的吞噬量均得到恢复,说明清道夫受体参与介导BMDM对Fe3O4-NPs的吞噬行为,且后续BMDM对RBCs吞噬功能下降与其对Fe3O4-NPs的吞噬相关;与未加入DFO的25μg/ml Fe3O4-NPs处理组相比,DFO预处理组Fe3O4-NPs暴露后BMDM对新鲜及储存GFP-RBCs的吞噬量均得到明显提升,且对新鲜GFP-RBCs吞噬量恢复至BMDM直接孵育GFP-RBCs时水平,但对储存GFP-RBCs吞噬数量并未恢复至原始值,可能因大量储存RBCs的吞噬已对BMDM造成器质性损害。而DFO未能恢复“铁死亡”BMDM对RBCs吞噬作用。而PS-NPs预处理BMDM组,其对新鲜和储存终末期GFP-RBCs的吞噬量反而增加。上述结果提示我们,首先,Fe3O4-NPs预暴露后BMDM噬红功能的降低来源于其对Fe3O4-NPs的吞噬;而“铁过载”抑制剂DFO对BMDM噬红功能的恢复,说明BMDM“铁过载”是噬红功能降低机制的“中心环节”,而纳米颗粒在胞内“空间占位”效应与该机制无关。（6）Fe3O4-NPs引起机体“铁过载”及对后续红细胞输注体内清除代谢影响研究。依据文献报道小鼠核磁成像的耐受剂量,对小鼠尾静脉输注36 mg/kg Fe3O4-NPs,构建“铁过载”动物模型;Fe3O4-NPs输注12 h后,每只小鼠输注200μl（约1×10~9个）GFP-RBCs,并设计分组:Control（只输注生理盐水组）、RBCs（只输注GFP-RBCs组）、Pre-Fe3O4（只输注Fe3O4-NPs组）和Pre-Fe3O4+RBCs（Fe3O4-NPs和GFP-RBCs先后输注组）,流式细胞术监测GFP-RBCs体内清除状况,检测Fe3O4-NPs和GFP-RBCs输注前/后,小鼠体内铁代谢调控指标（血清铁、铁调素、转铁蛋白、转铁蛋白受体和铁蛋白）的变化。并对小鼠进行解剖,摘取心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏,进行切片HE和普鲁士蓝染色以及脏器铁元素的电感耦合等离子体质谱（Inductively Coupled Plasma–Mass Spectrometry,ICP-MS）测量。并通过流式细胞术分析输注Fe3O4-NPs小鼠体内肝脏和脾脏的巨噬细胞亚群分化。体内结果显示,相比Control组,Pre-Fe3O4组血清铁（1.1±0.1 vs.1.9±0.4）、铁蛋白（21.8±3.4 vs.30.6±3.3）和铁调素（2.9±0.2 vs.3.7±0.3）含量增加,转铁蛋白（1028.5±98.3 vs.818.7±77.4）和可溶性转铁蛋白受体（737.0±21.1 vs.540.8±74.1）表达下调,差异均具有统计学意义（P＜0.01）,表示已成功构建“铁过载”动物模型;与RBCs组相比,Pre-Fe3O4+RBCs组增加输注GFP-RBCs体内回收率（Post-transfusion recovery,PTR）,且在输注RBCs48 h时回收率出现显著性差异（P＜0.05）,进一步在该时间点发现各处理组脏器病理切片均无明显改变;而脏器切片普鲁士蓝染色和ICP-MS表示小鼠体内输注Fe3O4-NPs主要积聚在肝脏和脾脏;输注GFP-RBCs体内回收率差异在72 h时间点消失,推断“铁过载”或”铁死亡”后体内可能有其他细胞分化成为负责红细胞清除的细胞亚群,后续在48 h时间点,进一步对Pre-Fe3O4组肝脏和脾脏巨噬细胞亚群分析结果显示,Pre-Fe3O4在48 h时间点,即对应Pre-Fe3O4+RBCs组输注GFP-RBCs 48 h,肝脏和脾脏均产生CD11b+和F4/80+的瞬时巨噬细胞（transmit macrophage,t MΦ）,分别占比为25.95%±3.67%和5.27%±0.16%,表明肝脏和脾脏可能出现涉及肝脏枯否细胞、脾脏红髓巨噬细胞与瞬时巨噬细胞之间细胞表型转换和补充。结论:25μg/ml低剂量Fe3O4-NPs体外暴露会抑制BMDM后续对RBCs的吞噬和清除,进一步机制研究表明该现象是由于Fe3O4-NPs预先以清道夫受体参与介导的BMDM吞噬造成的BMDM“铁过载”引起,而不是纳米颗粒细胞在胞内的“空间占位”效应导致的;而50μg/ml或以上的高剂量Fe3O4-NPs处理则诱发BMDM“铁死亡”,且该“铁死亡”也为是铁离子依赖性的,因该现象可被DFO抑制。体内输注高剂量（36 mg/kg）Fe3O4-NPs可造成机体“铁过载”,伴有血清铁、铁蛋白和铁调素含量升高;转铁蛋白和转铁蛋白受体表达下调,并且显著延长输注RBCs体内保留时间,该现象可能与Fe3O4-NPs富集在肝脏和脾脏,造成巨噬细胞“铁过载”或者“铁死亡”后,影响肝脏枯否细胞及脾脏红髓巨噬细胞功能有关;而随着时间推移,差异消失可能与上述两个脏器中表达CD11b+和F4/80+的瞬时巨噬细胞数量增加有关。