背景及目的N6-甲基腺苷（m~6A）修饰是真核生物m RNA中最丰富的内部修饰之一,在多种生物学过程中发挥着重要作用。RNA甲基转移酶（如甲基转移酶样3/甲基转移酶样14复合物）和RNA去甲基化酶（如脂肪量和肥胖相关蛋白（FTO）和Alk B同源物5（ALKBH5））可以分别从核酸碱基中“添加”和“去除”甲基,从而动态调节m~6A修饰的水平。RNA去甲基化酶FTO的异常表达与多种人类疾病（例如肥胖、糖尿病、癌症和阿尔茨海默症等）密切相关。因此,灵敏检测RNA去甲基化酶FTO并筛选其抑制剂对于生物医学研究和临床诊断至关重要。大肠杆菌毒素蛋白Maz F是一种对m~6A敏感的RNA切割酶,已成为FTO分析和抑制剂筛选的最佳工具。滚环扩增技术（RCA）是一种核酸扩增方法,RCA与其它功能单元（如纳米材料、脱氧核酶、限制性内切酶等）相结合为生物标志物的灵敏检测提供了一个高选择性平台。本论文研究旨在开发一种简单灵敏的方法,用于RNA去甲基化酶FTO的活性检测及其抑制剂筛选。方法（1）实验设计了一种具有5’-m~6ACA-3’序列的RNA探针作为底物,并对RNA探针的3’末端进行了NH2修饰。RNA去甲基化酶FTO检测步骤主要包括:（Ⅰ）FTO催化的RNA探针的去甲基化和随后利用Maz F对去甲基化的RNA探针进行切割;（Ⅱ）T4 PNK催化引物的2’,3’-环磷酸末端去磷酸化,产生3’-羟基末端;（Ⅲ）PG-RCA反应。（2）通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析、荧光发射光谱测量以及实时荧光测量验证该检测方法的可行性。（3）为了获得实验的最佳检测性能,优化了反应体系中许多关键因素。在最佳实验条件下,我们检测了由不同浓度FTO所产生的荧光信号,进而评估该检测方法的灵敏度和检测限。（4）利用几种非特异性酶和蛋白质作为干扰物来研究该检测方法的选择性。（5）将FTO和不同浓度的RNA探针混合反应,测量其10分钟的初始速度（V）,然后通过将数据拟合到米氏方程获得FTO的酶动力学参数。（6）选择大黄酸和双醋瑞因作为模型抑制剂,用于验证该方法是否可用于筛选FTO抑制剂。（7）最后利用所建立的方法检测了乳腺癌细胞（MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞）、宫颈癌细胞（He La细胞）和正常乳腺细胞（MCF-10A细胞）细胞质提取物中的FTO活性。结果（1）通过非变性PAGE分析、荧光发射光谱测量以及实时荧光测量成功验证切割反应和PG-RCA反应的发生。（2）通过优化一系列实验条件提高了实验的检测性能。该方法具有超高的灵敏度和极大的动态范围,检测限低至7.62×10-6 n M,动态范围从1×10-5 n M到1 n M达5个数量级。（3）该方法对FTO表现出良好的选择性,对非特异性酶或蛋白质无反应,可用于准确评估FTO的动力学参数,最大初始速度(Vmax)和米氏常数（Km）分别为19.97 n M/min和670.37 n M。（4）通过该方法计算出双醋瑞因的最大半数抑制值(IC50)为0.96μM,大黄酸为30.91μM。（5）该方法能检测复杂生物样品中的FTO活性,并且能区分癌细胞和正常细胞,甚至可以在单细胞水平上检测FTO。结论我们首次发展了一种无标记的荧光方法,利用Maz F介导的引物生成型滚环扩增方法灵敏检测脂肪量和肥胖相关蛋白（FTO）的活性。该方法非常简单,灵敏度高,特异性好,可在单细胞水平检测FTO活性。该方法可以进一步应用于评估FTO的动力学参数,筛选FTO抑制剂。