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研究背景与目的
结直肠癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着人类的健康和生命安全。临床上，结直肠癌具有难发现、易转移的特点，早期结直肠癌通常可以得到治愈，然而许多患者在诊断时已进展至晚期，并伴随远处转移。目前用于治疗结直肠癌的化疗药物如5-氟尿嘧啶(5-FU)等常见以细胞毒作用为主，无法有效抑制晚期结直肠癌的转移，且副作用多，毒性较大，这无疑加大了结直肠癌的治疗难度。缺氧是促进结直肠癌转移的关键因素之一，通过调节氧化代谢等途径，肿瘤细胞可以适应缺氧微环境，诱导血管生成，促进肿瘤的侵袭和转移。因此，在缺氧条件下寻找毒性低、抑制转移效果好的治疗药物是改善晚期结直肠癌疗效的关键。槲皮素是一种来源于植物的天然化合物，其抗肿瘤活性近年来被广泛报道。在体外，槲皮素可以抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移，在结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌等多种癌症中均有初步研究。然而，槲皮素对结直肠癌的侵袭转移尤其是缺氧条件下的侵袭转移的影响以及槲皮素与5-FU合用治疗缺氧条件下的晚期结直肠癌的侵袭转移作用均未见有文献报道。在本论文中，我们构建了体外缺氧培养模型，以高转移性晚期结直肠癌细胞模型为研究对象，低转移性原位结直肠癌细胞模型作为对照，探究槲皮素在缺氧条件下是否对结直肠癌增殖、侵袭、自噬、迁移、凋亡产生影响，并探讨其潜在的分子机制，同时观察槲皮素与5-FU合用协同抑制缺氧条件下的晚期结直肠癌侵袭转移作用，以期发掘槲皮素在晚期结直肠癌转移治疗中的潜在价值。
实验方法和结果
实验方法
1.检测缺氧条件下槲皮素对结直肠癌细胞的毒性作用
为探究缺氧条件下槲皮素对结直肠癌细胞的毒性作用，本论文选用晚期高转移性结直肠癌细胞系LOVO和低转移性原位结直肠癌细胞系HT-29作为研究对象。首先，使用低氧培养系统模拟肿瘤缺氧微环境(1％O2，5％CO2，37℃)建立体外细胞缺氧培养模型。然后采用CCK-8法检测缺氧条件下使用不同浓度槲皮素处理LOVO、HT-29细胞24h、48h、72h后对其生存率的影响，并计算IC50。
2.检测缺氧条件下槲皮素对LOVO、HT-29细胞侵袭、迁移能力的影响
为探究缺氧条件下槲皮素对LOVO、HT-29细胞侵袭、迁移能力的影响，采用Transwell实验、划痕实验检测缺氧条件下0、10、20、40μmol/L槲皮素处理24h后对LOVO、HT-29细胞侵袭、迁移能力的影响;Westernblot实验检测缺氧条件下0、10、20、40μmol/L槲皮素处理24h后，细胞中侵袭、迁移相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、MMP-9、MMP-2、Snail的表达水平。实验设计常氧对照组。
3.检测缺氧条件下槲皮素对LOVO细胞中ROS、HIF-1α水平的影响
缺氧环境下，肿瘤细胞中的ROS、HIF-1α尝呈现高表达，是调控肿瘤缺氧代谢的关键因子。使用DCFH-DA荧光探针标记0、10、20、40μmol/L槲皮素处理24h后的LOVO细胞中的ROS，采用倒置荧光显微镜及流式细胞仪对细胞中绿色荧光强度进行检测;采用免疫荧光法、倒置荧光显微镜拍摄检测0、10、20、40μmol/L槲皮素处理24h后的LOVO细胞中HIF-1α的荧光强度。实验均设计常氧对照组。
4.检测缺氧条件下槲皮素对LOVO细胞迁移的影响是否依赖于PI3K/AKT信号通路
PI3K/AKT的活化是促进肿瘤细胞侵袭、迁移的关键通路之一。为探究缺氧条件下槲皮素对LOVO细胞迁移的影响是否依赖于PI3K/AKT信号通路，采用Westernblot实验检测缺氧条件下0、10、20、40μmol/L槲皮素处理LOVO细胞24h后对LOVO细胞中PI3K、p-AKT、AKT蛋白表达水平的影响。然后，在缺氧条件下使用AKT抑制剂MK-2206阻断AKT的磷酸化过程，检测在AKT失活的前提下，40μmol/L槲皮素处理24h对LOVO细胞迁移的抑制效果，来验证PI3K/AKT通路在槲皮素抑制结直肠癌转移中发挥的作用。实验设计常氧对照组。
5.检测缺氧条件下槲皮素对LOVO细胞迁移的影响是否依赖于Ras/MEK/ERK信号通路
Ras/MEK/ERK通路的活化是促进肿瘤细胞侵袭、迁移的重要机制之一。PI3K/AKT信号通路及MEK/ERK信号通路都是Ras的下游通路。为探究缺氧条件下槲皮素对LOVO细胞迁移的影响是否依赖于Ras/MEK/ERK信号通路，采用Westernblot实验检测缺氧条件下0、10、20、40μmol/L槲皮素处理LOVO细胞24h后对LOVO细胞中pan-Ras、p-MEK、MEK、p-ERK、ERK蛋白表达水平的影响。实验设计常氧对照组。
6.检测缺氧条件下槲皮素对LOVO、HT-29细胞自噬的影响
为检测缺氧条件下槲皮素对LOVO、HT-29细胞自噬的影响，采用倒置荧光显微镜观察缺氧条件下0、20、40、80μmol/L槲皮素处理LOVO、HT-29细胞24h后对LOVO、HT-29细胞形态的影响;吖啶橙染色法观察缺氧条件下0、20、40、80μmol/L槲皮素处理LOVO、HT-29细胞24h后，LOVO、HT-29细胞中酸性自噬泡数量的变化。同时，采用吖啶橙染色法检测常氧条件下0、20、40、80μmol/L槲皮素处理LOVO细胞后LOVO细胞中酸性自噬泡数量的变化。
7.检测缺氧条件下槲皮素抑制LOVO细胞迁移是否与其诱导LOVO细胞自噬有关
为检测缺氧条件下槲皮素抑制LOVO细胞迁移是否与其诱导LOVO细胞自噬有关，使用自噬抑制剂BafilomycinA1抑制缺氧条件下槲皮素诱导的LOVO细胞自噬，采用倒置荧光显微镜及吖啶橙染色法观察缺氧条件下合用20nmol/LBafilomycinA1处理LOVO细胞24h后对40μmol/L槲皮素诱导的LOVO细胞自噬的抑制效果;采用划痕实验检测缺氧条件下合用20nmol/LBafilomycinA1处理LOVO细胞24h后对40μmol/L槲皮素抑制LOVO细胞迁移的影响。
8.检测缺氧条件下槲皮素对LOVO、HT-29细胞凋亡的影响
为探究缺氧条件下槲皮素对LOVO、HT-29细胞凋亡的影响，分别采用Hoechst33342染色法、Annexin-FITC/PI双染法定性、定量地检测缺氧条件下0、20、40、80、160μmol/L槲皮素处理LOVO细胞48h后对LOVO、HT-29细胞凋亡的影响。实验设计常氧对照组。
9.检测缺氧条件下槲皮素与5-FU合用对LOVO细胞的毒性作用
为探究缺氧条件下槲皮素与5-FU合用对LOVO细胞的毒性作用，采用CCK-8法检测缺氧条件下使用0、10、20、40μmol/L槲皮素分别与0、12.5、25、50μmol/L5-FU合用处理LOVO细胞48h后对LOVO细胞生存率的影响。
10.检测缺氧条件下槲皮素与5-FU合用对LOVO细胞侵袭、迁移能力的影响
为探究缺氧条件下槲皮素与5-FU合用对LOVO细胞侵袭、迁移能力的影响，采用Transwell实验、划痕实验检测缺氧条件下0、40μmol/L槲皮素与0、25μmol/L5-FU合用处理LOVO细胞24h后对LOVO细胞侵袭、迁移能力的影响。实验设计常氧对照组。
实验结果
1.检测缺氧条件下槲皮素抑制LOVO、HT-29细胞的增殖
缺氧条件下，槲皮素显著抑制LOVO、HT-29细胞的增殖，该抑制效果具有时间依赖性和浓度依赖性。槲皮素处理24h、48h、72h对LOVO、HT-29细胞的IC50，分别是:347.43μmol/L、93.28μmol/L、59.65μmol/L;153.97μmol/L、85.18μmol/L、65.47μmol/L。相比于晚期高转移性结直肠癌LOVO细胞系，槲皮素对低转移性原位结直肠癌HT-29细胞系有相似的增殖抑制效果。
2.缺氧条件下槲皮素抑制LOVO细胞的侵袭、迁移及相关蛋白的表达
缺氧条件下，槲皮素显著抑制LOVO细胞的侵袭、迁移，该抑制效果具有浓度依赖性。分别使用10、20、40μmol/L槲皮素处理LOVO细胞24h，细胞侵袭率分别降低至82.12％、64.30％、26.35％，迁移率分别降低至82.51％、40.14％、37.94％;槲皮素处理后，细胞内E-cadherin表达升高、N-cadherin表达降低，说明EMT过程受到抑制，MMP-9、MMP-2、Snail的表达水平降低，说明细胞侵袭迁移能力受到抑制。
3.缺氧条件下HT-29具有较低的侵袭、迁移潜力，槲皮素对此无明显影响
与常氧对照相比，缺氧条件下，Transwell实验中穿过小室的HT-29细胞有所增加，但总体数目仍较少。同时划痕实验表明，缺氧条件下使用0、10、20、40μmol/L槲皮素处理HT-29细胞24h后，HT-29细胞迁移率没有明显变化，各组几乎不发生迁移。说明缺氧条件下，HT-29具有较低的侵袭、迁移潜力，槲皮素对此无明显影响。
4.缺氧条件下槲皮素抑制LOVO细胞中ROS、HIF-1α的表达水平
缺氧条件下，槲皮素显著抑制LOVO细胞的中ROS、HIF-1α的表达水平，该抑制效果具有浓度依赖性。与常氧对照组相比，缺氧对照组的ROS、HIF-1α水平明显上升，分别使用10、20、40、μmol/L槲皮素处理LOVO细胞24h后，随槲皮素浓度的升高，细胞内ROS、HIF-1α的荧光强度明显降低，说明缺氧条件下，槲皮素抑制LOVO细胞中ROS、HIF-1α的表达水平。
5.缺氧条件下槲皮素通过抑制LOVO细胞中PI3K/AKT信号通路抑制其迁移能力
分别使用10、20、40μmol/L槲皮素处理LOVO细胞24h后，p-AKT的表达水平降低，PI3K、AKT水平无变化，说明缺氧条件下槲皮素抑制了LOVO细胞中PI3K/AKT信号通路。合用MK-2206抑制AKT的活化后，槲皮素通过AKT产生的迁移抑制作用被掩盖，致其对LOVO细胞迁移的抑制效果减弱，说明缺氧条件下槲皮素通过抑制LOVO细胞中PI3K/AKT信号通路抑制其迁移。
6.缺氧条件下槲皮素对LOVO细胞中Ras/MEK/ERK信号通路无明显影响
缺氧条件下使用10、20、40μmol/L槲皮素处理LOVO细胞24h后，pan-Ras、p-MEK、MEK、p-ERK、ERK的表达水平不产生明显变化，说明缺氧条件下槲皮素对LOVO细胞中Ras/MEK/ERK信号通路无明显影响。
7.缺氧条件下槲皮素诱导LOVO、HT-29细胞自噬
缺氧条件下分别使用20、40、80μmol/L槲皮素处理LOVO、HT-29细胞24h后，LOVO、HT-29细胞边界更加不清晰、细胞器皱缩加重，并可见细胞内产生空泡样结构。吖啶橙染色结果表明，随槲皮素浓度的升高，LOVO、HT-29细胞内被吖啶橙染成红色的酸性自噬泡明显增加。说明缺氧条件下，槲皮素诱导了LOVO、HT-29细胞的自噬，并且对晚期高转移性结直肠癌LOVO细胞系的自噬诱导作用强于低转移性原位结直肠癌HT-29细胞系。
8.常氧条件下槲皮素对LOVO细胞自噬无明显影响
常氧条件下分别使用20、40、80μmol/L槲皮素处理LOVO细胞24h后，随槲皮素浓度的升高，细胞内被吖啶橙染成红色的酸性自噬泡无明显变化。说明常氧条件下槲皮素对LOVO细胞自噬无明显影响。
9.缺氧条件下槲皮素诱导自噬与其抑制LOVO迁移无明显相关性
缺氧条件下，40μmol/L槲皮素处理LOVO细胞24h后，细胞的自噬水平上升。联合使用20nmol/LBafilomycinA1处理后，LOVO细胞边界变清晰、细胞内空泡样结构消失，细胞内被吖啶橙染成红色的酸性自噬泡明显减少。说明缺氧条件下，20nmol/LBafilomycinA1抑制了槲皮素诱导的LOVO细胞自噬。缺氧条件下分别使用20nmol/LBafilomycinA1、40μmol/L槲皮素及BafilomycinA1与槲皮素合用处理LOVO细胞24h。划痕实验结果显示，与槲皮素单用组相比，BafilomycinA1与槲皮素合用组表现出无统计学差异的迁移率。说明缺氧条件下，合用BafilomycinA1抑制槲皮素诱导的LOVO细胞自噬对槲皮素抑制LOVO细胞迁移不产生明显影响。这些结果表明在缺氧条件下，槲皮素诱导自噬与其抑制LOVO迁移无明显相关性。
10.缺氧条件下槲皮素诱导LOVO、HT-29细胞凋亡
使用20、40、80、160μmol/L槲皮素处理LOVO、HT-29细胞24h后，细胞核多见膨胀破碎或皱缩现象，多呈肾形或马蹄状，并且染色质浓缩深染，呈强蓝色荧光，出现凋亡小体，且随槲皮素浓度升高，凋亡细胞数目明显增多。流式细胞术结果表明，使用20、40、80、160μmol/L槲皮素处理LOVO细胞24h及48h后，80、160μmol/L槲皮素处理后的细胞凋亡率分别升高至6.23％、30.67％及12.33％、71.71％。
11.缺氧条件下槲皮素对5-FU抑制LOVO细胞的增殖作用无明显影响
缺氧条件下，5-FU合用0、10、20、40μmol/L槲皮素处理LOVO细胞48h的IC50分别是:41.67μmol/L、39.40μmol/L、47.23μmol/L、36.82μmol/L。可以看出，在合用不同浓度槲皮素后，5-FU对LOVO细胞的增殖抑制作用无明显改变，说明槲皮素对5-FU抑制LOVO细胞的增殖作用无明显影响。
12.缺氧条件下槲皮素与5-FU合用协同抑制LOVO细胞的侵袭、迁移
缺氧条件下，分别使用20μmol/L5-FU、40μmol/L槲皮素及5-FU与槲皮素合用处理LOVO细胞24h，与缺氧对照组相比，LOVO细胞的侵袭、迁移能力明显被抑制，侵袭率分别由65.25％、38.36％降低至28.93％，迁移率分别由69.66％、31.21％降低至24.75％。
实验结论
1.缺氧条件下，槲皮素抑制晚期转移性结直肠癌LOVO细胞系的增殖、侵袭、迁移，诱导其自噬与凋亡;抑制低转移性原位结直肠癌HT-29细胞系的增殖，诱导其自噬与凋亡，但不影响其侵袭和迁移能力。
2.缺氧条件下，槲皮素抑制LOVO细胞侵袭、迁移可能与其抑制细胞中ROS、HIF-1α的表达水平及PI3K/AKT通路活化有关，与Ras/MEK/ERK信号通路及其诱导的LOVO细胞自噬无明显关系。
3.缺氧条件下，槲皮素与5-FU合用对5-FU抑制LOVO细胞的增殖作用无明显影响。但是，槲皮素与5-FU合用可以显著协同抑制LOVO细胞的侵袭和迁移。
结直肠癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着人类的健康和生命安全。临床上，结直肠癌具有难发现、易转移的特点，早期结直肠癌通常可以得到治愈，然而许多患者在诊断时已进展至晚期，并伴随远处转移。目前用于治疗结直肠癌的化疗药物如5-氟尿嘧啶(5-FU)等常见以细胞毒作用为主，无法有效抑制晚期结直肠癌的转移，且副作用多，毒性较大，这无疑加大了结直肠癌的治疗难度。缺氧是促进结直肠癌转移的关键因素之一，通过调节氧化代谢等途径，肿瘤细胞可以适应缺氧微环境，诱导血管生成，促进肿瘤的侵袭和转移。因此，在缺氧条件下寻找毒性低、抑制转移效果好的治疗药物是改善晚期结直肠癌疗效的关键。槲皮素是一种来源于植物的天然化合物，其抗肿瘤活性近年来被广泛报道。在体外，槲皮素可以抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移，在结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌等多种癌症中均有初步研究。然而，槲皮素对结直肠癌的侵袭转移尤其是缺氧条件下的侵袭转移的影响以及槲皮素与5-FU合用治疗缺氧条件下的晚期结直肠癌的侵袭转移作用均未见有文献报道。在本论文中，我们构建了体外缺氧培养模型，以高转移性晚期结直肠癌细胞模型为研究对象，低转移性原位结直肠癌细胞模型作为对照，探究槲皮素在缺氧条件下是否对结直肠癌增殖、侵袭、自噬、迁移、凋亡产生影响，并探讨其潜在的分子机制，同时观察槲皮素与5-FU合用协同抑制缺氧条件下的晚期结直肠癌侵袭转移作用，以期发掘槲皮素在晚期结直肠癌转移治疗中的潜在价值。
实验方法和结果
实验方法
1.检测缺氧条件下槲皮素对结直肠癌细胞的毒性作用
为探究缺氧条件下槲皮素对结直肠癌细胞的毒性作用，本论文选用晚期高转移性结直肠癌细胞系LOVO和低转移性原位结直肠癌细胞系HT-29作为研究对象。首先，使用低氧培养系统模拟肿瘤缺氧微环境(1％O2，5％CO2，37℃)建立体外细胞缺氧培养模型。然后采用CCK-8法检测缺氧条件下使用不同浓度槲皮素处理LOVO、HT-29细胞24h、48h、72h后对其生存率的影响，并计算IC50。
2.检测缺氧条件下槲皮素对LOVO、HT-29细胞侵袭、迁移能力的影响
为探究缺氧条件下槲皮素对LOVO、HT-29细胞侵袭、迁移能力的影响，采用Transwell实验、划痕实验检测缺氧条件下0、10、20、40μmol/L槲皮素处理24h后对LOVO、HT-29细胞侵袭、迁移能力的影响;Westernblot实验检测缺氧条件下0、10、20、40μmol/L槲皮素处理24h后，细胞中侵袭、迁移相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、MMP-9、MMP-2、Snail的表达水平。实验设计常氧对照组。
3.检测缺氧条件下槲皮素对LOVO细胞中ROS、HIF-1α水平的影响
缺氧环境下，肿瘤细胞中的ROS、HIF-1α尝呈现高表达，是调控肿瘤缺氧代谢的关键因子。使用DCFH-DA荧光探针标记0、10、20、40μmol/L槲皮素处理24h后的LOVO细胞中的ROS，采用倒置荧光显微镜及流式细胞仪对细胞中绿色荧光强度进行检测;采用免疫荧光法、倒置荧光显微镜拍摄检测0、10、20、40μmol/L槲皮素处理24h后的LOVO细胞中HIF-1α的荧光强度。实验均设计常氧对照组。
4.检测缺氧条件下槲皮素对LOVO细胞迁移的影响是否依赖于PI3K/AKT信号通路
PI3K/AKT的活化是促进肿瘤细胞侵袭、迁移的关键通路之一。为探究缺氧条件下槲皮素对LOVO细胞迁移的影响是否依赖于PI3K/AKT信号通路，采用Westernblot实验检测缺氧条件下0、10、20、40μmol/L槲皮素处理LOVO细胞24h后对LOVO细胞中PI3K、p-AKT、AKT蛋白表达水平的影响。然后，在缺氧条件下使用AKT抑制剂MK-2206阻断AKT的磷酸化过程，检测在AKT失活的前提下，40μmol/L槲皮素处理24h对LOVO细胞迁移的抑制效果，来验证PI3K/AKT通路在槲皮素抑制结直肠癌转移中发挥的作用。实验设计常氧对照组。
5.检测缺氧条件下槲皮素对LOVO细胞迁移的影响是否依赖于Ras/MEK/ERK信号通路
Ras/MEK/ERK通路的活化是促进肿瘤细胞侵袭、迁移的重要机制之一。PI3K/AKT信号通路及MEK/ERK信号通路都是Ras的下游通路。为探究缺氧条件下槲皮素对LOVO细胞迁移的影响是否依赖于Ras/MEK/ERK信号通路，采用Westernblot实验检测缺氧条件下0、10、20、40μmol/L槲皮素处理LOVO细胞24h后对LOVO细胞中pan-Ras、p-MEK、MEK、p-ERK、ERK蛋白表达水平的影响。实验设计常氧对照组。
6.检测缺氧条件下槲皮素对LOVO、HT-29细胞自噬的影响
为检测缺氧条件下槲皮素对LOVO、HT-29细胞自噬的影响，采用倒置荧光显微镜观察缺氧条件下0、20、40、80μmol/L槲皮素处理LOVO、HT-29细胞24h后对LOVO、HT-29细胞形态的影响;吖啶橙染色法观察缺氧条件下0、20、40、80μmol/L槲皮素处理LOVO、HT-29细胞24h后，LOVO、HT-29细胞中酸性自噬泡数量的变化。同时，采用吖啶橙染色法检测常氧条件下0、20、40、80μmol/L槲皮素处理LOVO细胞后LOVO细胞中酸性自噬泡数量的变化。
7.检测缺氧条件下槲皮素抑制LOVO细胞迁移是否与其诱导LOVO细胞自噬有关
为检测缺氧条件下槲皮素抑制LOVO细胞迁移是否与其诱导LOVO细胞自噬有关，使用自噬抑制剂BafilomycinA1抑制缺氧条件下槲皮素诱导的LOVO细胞自噬，采用倒置荧光显微镜及吖啶橙染色法观察缺氧条件下合用20nmol/LBafilomycinA1处理LOVO细胞24h后对40μmol/L槲皮素诱导的LOVO细胞自噬的抑制效果;采用划痕实验检测缺氧条件下合用20nmol/LBafilomycinA1处理LOVO细胞24h后对40μmol/L槲皮素抑制LOVO细胞迁移的影响。
8.检测缺氧条件下槲皮素对LOVO、HT-29细胞凋亡的影响
为探究缺氧条件下槲皮素对LOVO、HT-29细胞凋亡的影响，分别采用Hoechst33342染色法、Annexin-FITC/PI双染法定性、定量地检测缺氧条件下0、20、40、80、160μmol/L槲皮素处理LOVO细胞48h后对LOVO、HT-29细胞凋亡的影响。实验设计常氧对照组。
9.检测缺氧条件下槲皮素与5-FU合用对LOVO细胞的毒性作用
为探究缺氧条件下槲皮素与5-FU合用对LOVO细胞的毒性作用，采用CCK-8法检测缺氧条件下使用0、10、20、40μmol/L槲皮素分别与0、12.5、25、50μmol/L5-FU合用处理LOVO细胞48h后对LOVO细胞生存率的影响。
10.检测缺氧条件下槲皮素与5-FU合用对LOVO细胞侵袭、迁移能力的影响
为探究缺氧条件下槲皮素与5-FU合用对LOVO细胞侵袭、迁移能力的影响，采用Transwell实验、划痕实验检测缺氧条件下0、40μmol/L槲皮素与0、25μmol/L5-FU合用处理LOVO细胞24h后对LOVO细胞侵袭、迁移能力的影响。实验设计常氧对照组。
实验结果
1.检测缺氧条件下槲皮素抑制LOVO、HT-29细胞的增殖
缺氧条件下，槲皮素显著抑制LOVO、HT-29细胞的增殖，该抑制效果具有时间依赖性和浓度依赖性。槲皮素处理24h、48h、72h对LOVO、HT-29细胞的IC50，分别是:347.43μmol/L、93.28μmol/L、59.65μmol/L;153.97μmol/L、85.18μmol/L、65.47μmol/L。相比于晚期高转移性结直肠癌LOVO细胞系，槲皮素对低转移性原位结直肠癌HT-29细胞系有相似的增殖抑制效果。
2.缺氧条件下槲皮素抑制LOVO细胞的侵袭、迁移及相关蛋白的表达
缺氧条件下，槲皮素显著抑制LOVO细胞的侵袭、迁移，该抑制效果具有浓度依赖性。分别使用10、20、40μmol/L槲皮素处理LOVO细胞24h，细胞侵袭率分别降低至82.12％、64.30％、26.35％，迁移率分别降低至82.51％、40.14％、37.94％;槲皮素处理后，细胞内E-cadherin表达升高、N-cadherin表达降低，说明EMT过程受到抑制，MMP-9、MMP-2、Snail的表达水平降低，说明细胞侵袭迁移能力受到抑制。
3.缺氧条件下HT-29具有较低的侵袭、迁移潜力，槲皮素对此无明显影响
与常氧对照相比，缺氧条件下，Transwell实验中穿过小室的HT-29细胞有所增加，但总体数目仍较少。同时划痕实验表明，缺氧条件下使用0、10、20、40μmol/L槲皮素处理HT-29细胞24h后，HT-29细胞迁移率没有明显变化，各组几乎不发生迁移。说明缺氧条件下，HT-29具有较低的侵袭、迁移潜力，槲皮素对此无明显影响。
4.缺氧条件下槲皮素抑制LOVO细胞中ROS、HIF-1α的表达水平
缺氧条件下，槲皮素显著抑制LOVO细胞的中ROS、HIF-1α的表达水平，该抑制效果具有浓度依赖性。与常氧对照组相比，缺氧对照组的ROS、HIF-1α水平明显上升，分别使用10、20、40、μmol/L槲皮素处理LOVO细胞24h后，随槲皮素浓度的升高，细胞内ROS、HIF-1α的荧光强度明显降低，说明缺氧条件下，槲皮素抑制LOVO细胞中ROS、HIF-1α的表达水平。
5.缺氧条件下槲皮素通过抑制LOVO细胞中PI3K/AKT信号通路抑制其迁移能力
分别使用10、20、40μmol/L槲皮素处理LOVO细胞24h后，p-AKT的表达水平降低，PI3K、AKT水平无变化，说明缺氧条件下槲皮素抑制了LOVO细胞中PI3K/AKT信号通路。合用MK-2206抑制AKT的活化后，槲皮素通过AKT产生的迁移抑制作用被掩盖，致其对LOVO细胞迁移的抑制效果减弱，说明缺氧条件下槲皮素通过抑制LOVO细胞中PI3K/AKT信号通路抑制其迁移。
6.缺氧条件下槲皮素对LOVO细胞中Ras/MEK/ERK信号通路无明显影响
缺氧条件下使用10、20、40μmol/L槲皮素处理LOVO细胞24h后，pan-Ras、p-MEK、MEK、p-ERK、ERK的表达水平不产生明显变化，说明缺氧条件下槲皮素对LOVO细胞中Ras/MEK/ERK信号通路无明显影响。
7.缺氧条件下槲皮素诱导LOVO、HT-29细胞自噬
缺氧条件下分别使用20、40、80μmol/L槲皮素处理LOVO、HT-29细胞24h后，LOVO、HT-29细胞边界更加不清晰、细胞器皱缩加重，并可见细胞内产生空泡样结构。吖啶橙染色结果表明，随槲皮素浓度的升高，LOVO、HT-29细胞内被吖啶橙染成红色的酸性自噬泡明显增加。说明缺氧条件下，槲皮素诱导了LOVO、HT-29细胞的自噬，并且对晚期高转移性结直肠癌LOVO细胞系的自噬诱导作用强于低转移性原位结直肠癌HT-29细胞系。
8.常氧条件下槲皮素对LOVO细胞自噬无明显影响
常氧条件下分别使用20、40、80μmol/L槲皮素处理LOVO细胞24h后，随槲皮素浓度的升高，细胞内被吖啶橙染成红色的酸性自噬泡无明显变化。说明常氧条件下槲皮素对LOVO细胞自噬无明显影响。
9.缺氧条件下槲皮素诱导自噬与其抑制LOVO迁移无明显相关性
缺氧条件下，40μmol/L槲皮素处理LOVO细胞24h后，细胞的自噬水平上升。联合使用20nmol/LBafilomycinA1处理后，LOVO细胞边界变清晰、细胞内空泡样结构消失，细胞内被吖啶橙染成红色的酸性自噬泡明显减少。说明缺氧条件下，20nmol/LBafilomycinA1抑制了槲皮素诱导的LOVO细胞自噬。缺氧条件下分别使用20nmol/LBafilomycinA1、40μmol/L槲皮素及BafilomycinA1与槲皮素合用处理LOVO细胞24h。划痕实验结果显示，与槲皮素单用组相比，BafilomycinA1与槲皮素合用组表现出无统计学差异的迁移率。说明缺氧条件下，合用BafilomycinA1抑制槲皮素诱导的LOVO细胞自噬对槲皮素抑制LOVO细胞迁移不产生明显影响。这些结果表明在缺氧条件下，槲皮素诱导自噬与其抑制LOVO迁移无明显相关性。
10.缺氧条件下槲皮素诱导LOVO、HT-29细胞凋亡
使用20、40、80、160μmol/L槲皮素处理LOVO、HT-29细胞24h后，细胞核多见膨胀破碎或皱缩现象，多呈肾形或马蹄状，并且染色质浓缩深染，呈强蓝色荧光，出现凋亡小体，且随槲皮素浓度升高，凋亡细胞数目明显增多。流式细胞术结果表明，使用20、40、80、160μmol/L槲皮素处理LOVO细胞24h及48h后，80、160μmol/L槲皮素处理后的细胞凋亡率分别升高至6.23％、30.67％及12.33％、71.71％。
11.缺氧条件下槲皮素对5-FU抑制LOVO细胞的增殖作用无明显影响
缺氧条件下，5-FU合用0、10、20、40μmol/L槲皮素处理LOVO细胞48h的IC50分别是:41.67μmol/L、39.40μmol/L、47.23μmol/L、36.82μmol/L。可以看出，在合用不同浓度槲皮素后，5-FU对LOVO细胞的增殖抑制作用无明显改变，说明槲皮素对5-FU抑制LOVO细胞的增殖作用无明显影响。
12.缺氧条件下槲皮素与5-FU合用协同抑制LOVO细胞的侵袭、迁移
缺氧条件下，分别使用20μmol/L5-FU、40μmol/L槲皮素及5-FU与槲皮素合用处理LOVO细胞24h，与缺氧对照组相比，LOVO细胞的侵袭、迁移能力明显被抑制，侵袭率分别由65.25％、38.36％降低至28.93％，迁移率分别由69.66％、31.21％降低至24.75％。
实验结论
1.缺氧条件下，槲皮素抑制晚期转移性结直肠癌LOVO细胞系的增殖、侵袭、迁移，诱导其自噬与凋亡;抑制低转移性原位结直肠癌HT-29细胞系的增殖，诱导其自噬与凋亡，但不影响其侵袭和迁移能力。
2.缺氧条件下，槲皮素抑制LOVO细胞侵袭、迁移可能与其抑制细胞中ROS、HIF-1α的表达水平及PI3K/AKT通路活化有关，与Ras/MEK/ERK信号通路及其诱导的LOVO细胞自噬无明显关系。
3.缺氧条件下，槲皮素与5-FU合用对5-FU抑制LOVO细胞的增殖作用无明显影响。但是，槲皮素与5-FU合用可以显著协同抑制LOVO细胞的侵袭和迁移。