虽然转基因作物的种植面积在不断增加,带来了一定的社会和经济效益。但抗抗生素、抗虫及抗除草剂等外源基因潜在的食品和生态安全问题引发了人们的担忧,严重限制了转基因植物进一步商业化推广,导致转基因技术的巨大价值远未被兑现。如何在利用转基因技术的同时避免其安全隐患,是研究人员一直致力解决的重要问题。位点特异性DNA重组酶可以在其识别位点直接催化DNA片段的断裂、交换和重连接。根据两个重组酶识别位点的方向和位置,DNA重组反应可以导致DNA片段删除、整合、倒置及易位。Cre/loxP系统是目前应用和研究最广泛的重组酶系统,常用于动物中条件性基因删除,但其在植物中的删除效率较低。造成该系统在植物中低删除效率的原因仍不清楚。花粉和种子等生殖组织中转基因的存在是主要的安全隐患根源。用种系细胞（配子以及将要分化为配子的原始细胞的总称）启动子调控位点特异性重组酶系统介导的基因删除可将外源基因从生殖组织中删除,获得不含转基因的花粉和种子,同时保留根、茎、叶等营养组织中的转基因功能。要实现这“转基因植物生产非转基因产品”的目标,高效的启动子和重组酶系统是成功的两个先决条件。本文在烟草中筛选、改造了一系列启动子,研究了影响位点特异性DNA重组反应效率的因素。结果表明:（1）早期花特异启动子驱动下的Cre/loxP系统可以使靶标基因产物（mRNA和蛋白质）完全消除,然而靶标基因（DNA）却并未被真正地删除;（2）在Cre的作用下,loxP位点和靶标基因发生高度DNA甲基化修饰,导致基因删除被抑制和靶标基因沉默;（3）loxP位点上重组酶结合区域的CG甲基化对基因删除没有影响,而交叉区域的CHH甲基化在抑制loxP重组反应中起关键作用,致使Cre/loxP基因删除系统在富含非-CG甲基化背景的植物中效率低下;（4）Cre以一种不依赖siRNA的方式介导DNA甲基化精确地发生在整个floxed区域,使得在此区间内的基因被沉默。主要研究结果如下:1.种系细胞启动子的筛选和改造对不同物种来源的12个种系细胞启动子的效率进行了测试,以期筛选到精准、高效的启动子来控制基因删除系统。结果显示,以T1代烟草GFP荧光信号的阴性率为指标,不同的启动子控制下的基因删除系统的效率差异显著,在2.7～100%之间。三个烟草自身的早期花特异启动子,NtAGIP2、NtAP1La和NtAP1Lb1,效率达到100%。进一步对T0代NtAGIP2::Cre和NtAP1Lb1::Cre烟草的花序剖面进行GFP荧光观察,GFP信号分别从NtAGIP2::Cre烟草的雄雌蕊和NtAP1Lb1::Cre烟草的整个花中消失。GFP信号消失的部位与这两个启动子驱动GUS报告基因表达的部位相吻合,表明所筛选的启动子可以精准、高效的驱动Cre/loxP系统。启动子人工改造发现雄雌蕊特异的NtAGIP1启动子添加35S增强子后（35SNtAGIP1）,新启动子的活性从花中央扩展至整个花序,但并没有越过生殖器官进入营养组织。GUS酶活检测显示,相比NtAGIP1,35SNtAGIP1启动子活性显著增强。与此一致,T0代35SNtAGIP1::Cre烟草中GFP荧光从整个花序中消失。T1代GFP荧光消除率统计显示,35SNtAGIP1指导Cre的效率最高达到100%,而NtAGIP1最高为91.2%。启动子截短分析表明,NtAGI-1上含有GAGA元件的100-bp保守片段可以抑制35S增强子在营养组织中的活性,通过介导组蛋白3赖氨酸27位点的三甲基化（H3K27me3）修饰,使得35SNtAGIP1启动子活性提高的同时保留了花组织特异性。将NtAGIP1与AP1启动子融合后,GUS染色显示融合启动子不但没有获得AP1启动子在时期0-1的活性特征,而且失去了其在时期2雄雌蕊原基中的活性。相应地,新启动子介导的GFP荧光删除效率也大幅下降。这表明融合AP1和NtAGIP启动子并没有综合两个启动子的表达特征,取而代之的是互相拮抗。2.在多数情况下,Cre介导基因沉默而非真正的基因删除进一步对GFP荧光删除效率达到100%的NtAGIP2::Cre和NtAP1Lb1::Cre株系进行mRNA、蛋白质和DNA水平的验证。RT-PCR和Western blot检测不到GFP mRNA和GFP蛋白的存在。但基因组PCR检测发现,大部分后代中都能检测出GFP DNA。3个NtAGIP2::Cre株系GFP DNA删除效率分别为0%,0%,和14.6%;3个NtAP1Lb1::Cre株系的GFP DNA删除效率分别为5.0%、29.2%和0.0%,而不是预期的100%。通过在floxed区域外设计引物进行基因组PCR,证实floxed DNA仍保留在基因组原来的位置上,同时排除了环状DNA和floxed DNA重新整合入基因组其它位置的可能。测序显示loxP序列和控制GFP表达的35S启动子都没有发生突变。这些结果表明在Cre的作用下GFP基因发生了沉默,而不是被删除。3.loxP位点交叉区域的DNA甲基化抑制了loxP重组loxP位点有两个CG和三个CHH序列。亚硫酸氢盐测序法显示,NtAGIP2::Cre烟草雄雌蕊中loxP位点的CG和CHH序列发生高度甲基化,而与之相邻的萼片中几乎没有甲基化胞嘧啶信号。推测DNA甲基化会抑制重组酶介导的基因删除反应。DNA甲基化抑制剂5-Aza C处理F1代p35S::Cre×loxP-p35S::GFP-loxP种子,处理组删除效率达到81.9±6.4%,而水处理对照组删除效率仅为1.3±2.3%,删除效率提高了63倍。拟南芥中DNA甲基化的建立由DOMAINS REARRANGED METHYLASE 1 and 2（DRM1/2）催化。通过二次转化将DRM siRNA干扰载体导入GFP荧光阴性率为100%而GFP基因删除效率为0的NtAGIP2::Cre株系,获得3个NtDRM基因下调幅度在80%以上的二次转化子,其GFP荧光阴性率依然为100%。基因组PCR检测显示,3个株系的GFP DNA的删除效率分别为52.8%、48.6%和50.0%,分别比对照高出2.2-、1.9-和2.0倍（对照为16.7%）。化学和遗传干扰实验结果均表明,干扰DNA甲基化可以提高基因删除效率。为进一步研究甲基化对位点特异性DNA重组的抑制机制,对loxP位点的CG序列进行体外甲基化修饰,Cre介导的DNA体外重组试验显示,CG甲基化对基因删除没有影响;而当loxP位点的CHH也发生甲基化后,loxP重组被废除。考虑到CHH甲基化在植物中普遍存在,而动物中较少,这一结果为“Cre/loxP系统的删除效率在动物中高而在植物中低”提供了合理解释。在loxP位点中,两个CG序列位于重组酶结合最重要的区域,三个CHH序列的其中两个位于交叉区域,推测交叉区域的甲基化会阻止DNA重组的发生。R/RS重组酶系统的识别位点RS有一个CG序列在交叉区域。大肠杆菌中的重组试验显示,该交叉区域的CG序列发生甲基化后,R重组酶介导的DNA删除反应被抑制。这些结果表明,发生在交叉区域的DNA甲基化,不管是CG还是非-CG甲基化,可以抑制位点特异性重组酶介导的DNA重组反应。4.Cre以一种不依赖siRNA的方式介导floxed区域发生甲基化亚硫酸氢盐测序显示,在T0代NtAGIP2::Cre株系的雄雌蕊（GFP沉默）中,p35S启动子发生高度甲基化,而邻近的萼片（GFP表达）中该启动子几乎没有甲基化胞嘧啶信号。雄雌蕊中的高甲基化状态可稳定遗传给T1代。用DNA甲基化抑制剂5-Aza C处理T1代NtAGIP2::Cre种子,可恢复GFP基因的表达。进一步对T-DNA区域其它片段进行甲基化检测,发现T0代NtAGIP2::Cre的雄雌蕊中,不仅p35S启动子,所有处于floxed（loxP-flanked）区域的序列都发生了高度甲基化;而floxed区域外的其它片段,检测不到明显的甲基化信号。而在萼片中,除NtAGIP2启动子3’端的一小段序列外,整个T-DNA区域检测不到明显的甲基化胞嘧啶信号。在植物中,DNA定点甲基化由小干扰RNAs（small interferingRNAs;siRNAs）介导。但siRNA深度测序显示,除了NtAGIP2启动子3’端的一小段序列,不管是雄雌蕊还是萼片,整个T-DNA上没有检测到明显的siRNA转录本。生物信息学分析显示,这一小段序列在烟草基因组中有大量同源序列,可能是造成这段序列有对应siRNA合成并发生DNA甲基化的原因,但与Cre的表达无关。这些结果表明,Cre介导的floxed区域的DNA甲基化不依赖siRNAs。为进一步验证Cre介导的DNA甲基化的特性,将p NOS::Npt II表达框从floxed区域外围移入floxed区域。Cre表达后,包括p NOS::Npt II在内的整个floxed区域发生了不依赖siRNA的DNA甲基化和基因沉默,导致后代烟草失去了对卡那霉素的抗性。这表明只要位于floxed区域,都能在Cre的作用下发生DNA甲基化和基因沉默。综上所述,本文发现:Cre介导的DNA甲基化可覆盖整个floxed区域;loxP位点的甲基化抑制了DNA重组,同时loxP位点间序列的甲基化导致了floxed基因的沉默。本研究揭示了Cre/loxP重组酶系统在植物中删除效率低下的原因,为改进重组酶系统的效率提供了理论依据;在一些高效的花特异启动子控制下,这种Cre介导的甲基化可实现大片段序列（＞12kb）的高水平（100%）基因沉默,有望成为多基因靶向甲基化和表观遗传修饰的工具。此外,本文还发现Cre介导的DNA甲基化可能与siRNA的生物合成无关,由此提出重组酶介导的非siRNA依赖的DNA甲基化模型。