论文部分内容阅读
番茄是全世界重要的蔬菜作物之一,由镰刀菌属真菌番茄尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.Lycopemsici,FOL)引起的番茄枯萎病是一种番茄生产中主要的病害,给全球番茄农业生产造成巨大的经济损失。miRNA是内源基因编码的长度约为20-24个核苷酸的非编码单链RNA分子,参与转录后基因表达调控。本研究用FOL/H20处理具有相似遗传背景的番茄感病品种Moneymaker和抗病品种Motelle,取处理24 h后的番茄根部材料构建四个文库:MM_H2O,MM_FOL,Mot_H2O和Mot_FOL。(1)利用高通量测序技术挖掘到一个参与番茄-病原菌互作过程的尖孢镰刀菌内源特异miRNA:folmiR1。(2)结合Northern blot和qRT-RCR验证,确认folmiR1在番茄尖孢镰刀菌侵染番茄植株中富集;为了排除被侵染番茄根系材料中番茄尖孢镰刀菌自身miRNA的干扰,通过分离被侵染番茄根系原生质体,利用qRT-PCR的方法检测到folmiR1,证实番茄尖孢镰刀菌folmiR1在病原菌侵染番茄植株过程中通过某种未知机制跨界转运至寄主番茄细胞内。(3)通过生物信息学方法预测,发现folmiR1在番茄基因组中可能存在4个靶基因,qRT-PCR结果显示其中3个靶基因的表达水平与病原菌侵染负相关。烟草瞬时共表达结果进一步表明,folmiR1在转录水平调控其寄主番茄基因组中2个靶基因Solyc06g007430和Solyc07g065090的表达。(4)为了深入研究这两个靶基因的功能,通过病毒介导的基因沉默(VIGS)技术在抗病品种Motelle中分别部分沉默这两个靶基因,番茄尖孢镰刀菌侵染VIGS植株的结果表明Solyc06g007430和Solyc07g065090参与寄主番茄的抗病过程。(5)同时,分别将Solyc06g007430 和 Solyc07g065090 在感病品种 Moneymaker 中过表达,在抗病品种 Motelle中利用CRISPR/cas 9技术敲除,获得转基因材料,深入研究该基因抗枯萎病的功能。(6)通过VIGS技术将感病品种Moneymaker基因组中与miRNA功能相关的AGO、DCL和RDR家族的基因分别部分沉默后,发现Agol、Ago4a和Ago6基因沉默植株表现出对番茄尖孢镰刀菌侵染的抗性,暗示folmiRl可能通过与这些基因互作干扰寄主对番茄尖孢镰刀菌的抗性。Small RNA与特定的蛋白结合,形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC),从而触发RNA干扰(RNAi)机制,调控靶基因的表达。RNA依赖性RNA 聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RDR)是 RNAi 中一个关键酶,以单链 RNA为模板合成互补RNA链。RDR能够催化small RNA作为引物与靶RNA结合,产生更多新的dsRNA。本研究通过同源重组的方法获得RDR1敲除菌株,致病力鉴定结果表明RDR与病原菌致病力正相关。因此,本项目后续研究将以RDR1基因作为靶标,构建该基因RNA干扰载体,开发新型抗番茄尖孢镰刀菌杀菌剂防止番茄枯萎病。综上所述,本项目结果表明病原菌folmiR1跨界进入寄主番茄,并负调控番茄中与抗病相关的靶基因,为研究番茄抗枯萎病机理提供了独特研究视角;进一步阐明病原菌miRNA分子作为新的效应子在番茄-病原菌互作过程中的作用,揭示其精准调控番茄免疫体系的分子机制,可为开发以病原菌miRNA为靶标的番茄抗枯萎病防治策略提供新的思路和理论依据。