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睡眠呼吸障碍疾病（sleep-related disordered breathing,SRDB）是一组以睡眠中呼吸异常为主要表现的疾病,表现为在睡眠过程中反复出现呼吸暂停或低通气。SRDB主要包括阻塞性睡眠呼吸暂停、睡眠相关性肺泡低通气和中枢性睡眠呼吸暂停等。其中,先天性中枢性低通气综合征（congenital central hypoventilation syndrome,CCHS）是一种罕见的中枢性自主呼吸控制障碍疾病。根据美国胸科协会发布的指南,明确paired-like homeobox 2b（Phox2b）基因突变是CCHS的关键致病因素。Phox2b是位于第4对常染色体上的配对同源盒基因,其编码的同源域转录调控因子参与胚胎期自主神经系统的发育。Phox2b主要表达在参与调节呼吸和心血管反射的神经元上,包括孤束核（nucleus tractus solitarii,NTS）、斜方体后核（retrotrapezoid nucleus,RTN）和蓝斑核（locus coeruleus,LC）等,这些核团的神经元均具有中枢呼吸化学感受器的作用。研究表明,选择性激活Phox2bRTN或Phox2bNTS神经元均可增强中枢性呼吸驱动,增加肺通气;选择性破坏RTN或NTS的此类神经元均减弱高碳酸性通气反应。然而,关于Phox2bLC神经元是否参与呼吸调控尚待研究。LC位于脑桥背侧第四脑室的两侧,主要包括去甲肾上腺素能神经元,是中枢神经系统去甲肾上腺素能纤维投射的主要来源,并且参与众多生理功能的调控。尽管早期研究表明,损毁LC的儿茶酚胺能神经元可抑制高碳酸性通气反应,但是激活LC神经元对基础呼吸的作用仍需明确。此外,LC神经元的化学敏感性是其参与中枢呼吸化学感受器反射的基础,有报道指出,LC化学敏感性神经元的数量随年龄增加而减少,所以成年动物的LC神经元是否仍然保留pH敏感性尚需进一步研究。LC神经元可投射到调控自主神经系统的脑区,也接受来自NTS、RTN、臂旁核（parabranchial nucleus,PBN）和前包钦格复合体（pre B（?）tzinger Complex,preB（?）tC）等区域神经元的支配。但是,Phox2bLC神经元参与呼吸中枢调控的环路机制还未进行系统性研究。Phox2b调节胚胎期去甲肾上腺素能神经元的分化,影响去甲肾上腺素能神经元的生物化学表型。在CCHS致死患儿和Phox2b突变动物模型中都有LC神经元的缺失,但Phox2bLC神经元是否参与CCHS的病理生理过程尚不明确。因此,探讨Phox2bLC神经元对基础呼吸以及中枢呼吸化学感受器反射的影响具有重要的临床意义。综上分析,本研究旨在探讨Phox2bLC神经元在呼吸调控中的作用及其可能的环路机制。我们相信研究结果将有助于理解CCHS以及其它睡眠呼吸障碍疾病的发病机制,为这些疾病的精准干预提供新的思路。目的:Phox2bLC神经元在呼吸调控中的作用及其可能的环路机制。具体内容包括:（1）特异性激活Phox2bLC神经元对小鼠基础呼吸功能的影响;（2）选择性破坏Phox2bLC神经元对小鼠高碳酸性通气反应的影响;（3）分析成年小鼠Phox2bLC神经元的CO2敏感性;（4）明确Phox2bLC神经元与呼吸中枢模式发生器之间的轴突投射和功能联系。方法:实验选用成年雄性Phox2b-Cre和Phox2b-EGFP转基因小鼠。（1）应用全身无创体积描计系统（Whole Body Plethysmography,WBP）测量小鼠的肺功能,呼吸参数包括呼吸频率（respiratory frequency,RF）、潮气量（tidal volume,TV）和每分通气量（minute ventilation,MV）等;（2）化学遗传学技术:在Phox2b-Cre小鼠的LC注射含有编码人毒蕈碱型乙酰胆碱M3受体（h M3Dq）基因的腺相关病毒（AAV-EF1α-DIO-h M3Dq-mCherry）,h M3Dq能特异地在Phox2bLC神经元表达并被叠氮平-N-氧化物（clozapine-N-oxide,CNO）激活引起神经元兴奋。应用这种化学遗传学技术选择性激活清醒小鼠的Phox2bLC神经元,观察呼吸参数的变化;（3）光遗传学技术:在Phox2b-Cre小鼠的LC注射含有编码光敏感通道（Ch R2）基因的腺相关病毒（AAV-EF1α-DIO-ChR2-mCherry）,表达ChR2的神经元可被激光（473nm,8～10 m W,20 Hz）兴奋。应用光遗传学技术激活麻醉小鼠的Phox2bLC神经元,观察膈神经放电的变化;（4）在Phox2b-Cre小鼠的LC注射AAV-CAG-DIO-taCasp3-TEVp病毒,Casp3可特异性表达在Phox2bLC神经元并启动细胞凋亡,再观察高碳酸性通气反应的变化;（5）应用免疫组织化学技术,评估Phox2bLC神经元的CO2敏感性（cFos+）。（6）应用神经示踪技术,评估Phox2bLC神经元与呼吸中枢模式发生器之间的解剖学连接和功能学联系。结果:1.免疫荧光结果发现,绝大多数成年Phox2b-EGFP小鼠LC区的EGFP神经元表达Phox2b和TH;Phox2b+TH+神经元约占TH+神经元总数50%以上,占Phox2b+神经元总数52%以上。而且,Phox2b+神经元与TH+神经元在空间分布上存在差异,Phox2b+TH+神经元在LC尾端分布较多,在LC的头端则较少。PCR结果证实成年小鼠LC依然表达Phox2b。2.免疫荧光结果表明,转染的神经元（mCherry+神经元）中有92%表达Phox2b（Phox2b+mCherry+）,提示化学遗传学或光遗传学激活的神经元绝大多数为Phox2bLC神经元。3.化学遗传学方法特异性激活清醒小鼠Phox2bLC神经元可长时程增加RF和MV。此效应起效时间较慢,持续较长时间（>120分钟）。同时,呼气时间减少,但TV没有明显变化。4.在麻醉、维持机械通气、切断双侧迷走神经小鼠上,当呼气末二氧化碳浓度保持4%时,选择性刺激Phox2bLC神经元可适度增加膈神经放电频率（吸气频率）,放电幅度没有显著改变,表明中枢性呼吸驱动增强。5.当选择性破坏Phox2bLC神经元（Phox2b mRNA水平均降低40%）,吸入5%CO2时,实验组小鼠的TV和MV显著低于对照组;暴露于8%CO2时,实验组小鼠的RF、TV和MV均显著降低。因此,破坏一定比例的Phox2bLC神经元可减弱高碳酸性通气反应。6.当吸入8%CO2时,Phox2bLC神经元中有17%被激活,同时c Fos+神经元中有18%为Phox2bLC神经元,因此,Phox2bLC神经元的一个亚群具有CO2敏感性,是此类神经元是参与高碳酸性通气反应的基础。7.选择性刺激Phox2bLC神经元,preB（?）tC区内c Fos+神经元数量明显多于对照组,提示激活Phox2bLC神经元可提高preB（?）tC神经元的激活水平。8.神经示踪研究发现,Phox2bLC神经元的轴突可以直接投射到延髓腹外侧的呼吸中枢模式发生器preB（?）tC和呼吸调整中枢PBN,提示Phox2bLC神经元可能通过单突触联系直接影响呼吸中枢模式发生器的活动而调控呼吸运动。结论:选择性激活Phox2bLC神经元可增强中枢性呼吸驱动,增加基础状态下肺通气量;特异性损毁Phox2bLC可减弱中枢呼吸化学感受器反射。Phox2bLC神经元调控呼吸的作用可能是通过单突触联系直接调节呼吸中枢模式发生器和呼吸调整中枢的神经元实现的。