论文部分内容阅读
背景:髓核干细胞(Nucleus pulposus derived stem cells,NPSCs)的发现使退变髓核组织的内源性修复从理论变成现实。然而,目前针对人退变椎间盘源性NPSCs的生物学特性与应用潜能尚缺乏系统全面的研究。同时,在椎间盘退变过程中,NPSCs的损伤退变现象正逐渐受到重视。因此,基于NPSCs损伤退变的组织工程修复策略有望成为椎间盘退变生物学治疗的新方向。目的:1、探明人退变椎间盘源性NPSCs的生物学特性与应用潜能2、明确不同退变程度的椎间盘中,NPSCs生物学性能的改变3、验证功能化自组装多肽水凝胶RADA-RKPS对凋亡诱导环境中NPSCs的保护作用方法:1、收集临床上腰椎手术中废弃的髓核组织与同源骨髓血标本。分离、纯化并获取人退变椎间盘NPSCs。分别从细胞形态学观察、细胞增殖力、细胞周期、干细胞标志物检测、干性基因表达、三系诱导分化能力等方面与同源BMSCs进行比较,明确人退变椎间盘NPSCs的生物学特性与应用潜能。2、获取不同Pfirrmann分级的退变椎间盘来源NPSCs,通过对各组细胞形态学观察、增殖力检测、集落形成率、细胞衰老方面以及成软骨能力的比较,明确人不同退变Pfirmman分级椎间盘中NPSCs生物学特性的变化。3、利用多肽水凝胶RADA16-I与BMP-7活性片段制备功能化自组装多肽支架材料RADA-RKPS,并采用TNF-α体外诱导NPSCs凋亡。将实验分为RADA16-I、RADA16-I+TNF-α与 RADA-RKPS+TNF-α 三组。通过对比三组细胞活性、细胞增殖力、凋亡细胞比例与类髓核分化效果,验证功能化自组装多肽RADA-RKPS对NPSCs具有保护作用。结果:1、NPSCs与BMSCs在细胞形态、增殖能力、细胞周期、干性基因表达方面具有相类似的生物学特性。但在细胞免疫表型方面,NPSCs中CD105与CD166的表达明显比BMSCs更低。此外,在三系诱导中,两者的成骨能力无差异。但NPSCs的成脂能力比BMSCs稍差,但却拥有显著的成软骨能力。2、在退变椎间盘组织中,随着Pfirrnann分级增加,NPSCs在细胞形态、增殖力、集落形成率等方面均呈现下降趋势,而细胞衰老比例却明显升高。此外,上述性能在Pfirrmann Ⅲ级与Ⅳ级之间呈现显著差异改变。3、与单纯RADA16-I组相比,凋亡诱导组TUNEL阳性染色细胞比例明显增高,表明TNF-α成功诱导NPSCs体外凋亡。在凋亡诱导组中,RADA-RKPS组比单纯RADA16-I组中细胞活性、细胞增殖以及促进类髓核分化作用均有所升高且差异有统计学意义。此外,RADA-RKPS比单纯RADA16-I组凋亡细胞比例明显减少。结论:1、研究结果表明人退变椎间盘NPSCs与同源BMSCs具有相类似的干细胞特性,但NPSCs拥有更强的成软骨分化潜能。此外,干细胞免疫表型的差异结果提示NPSCs是间充质来源的,并非胚胎来源。因此,NPSCs相比BMSCs更加适合作为退变椎间盘修复的种子细胞。2、随着退变椎间盘的Pfirrmann分级的增加,NPSCs的生物学活性与细胞功能出现逐渐降低现象,并且在PfirrmannⅣ、Ⅴ级的细胞中显著下降。这种现象提示NPSCs的损伤退变可能是椎间盘早期退变的病理基础与始动因素。同时,Pfirrmann Ⅱ与Ⅲ级作为椎间盘退变的内源性修复的对象和时机更加具有合理性。3、功能化自组装多肽水凝胶RADA-RKPS对凋亡诱导环境中NPSCs具有保护作用,提示具有作为退变椎间盘组织工程材料的潜能。