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研究背景
红细胞的生理功能是通过血红蛋白运输氧和二氧化碳，临床上输注红细胞悬液能改善血流动力学，提高携氧量，维持机体的氧化反应。红细胞在体外储存过程中，细胞代谢、功能以及形态学相继发生改变，称之为储存损伤，英文特别用“storagelesion”形容，如：ATP、3-DPG浓度、NO及其衍生物等浓度的持续降低。离体条件下，一般使用CPDA血液保存液储存红细胞并放置于4℃的恒温冰箱中，保质期为35天。保存35天的红细胞输入患者身体后规定至少有70%的红细胞能发挥功能才属于有效输血，近30%红细胞会因为低温下的代谢原因，在体外已发生变形、衰老，很快在脾、骨髓或肝内被裂解溶血。找到与红细胞能量代谢、形态变化等相关的因素，用来抑制红细胞衰老速度，是解决血源紧张、改善单位红细胞的输注疗效的必经之路。
RNA可分为信使RNA(mRNA)、小分子RNA(miRNA)、环状RNA(circRNA)等，初步的研究表明成熟红细胞中也存在凋亡信号通路或程序性死亡通路(programmed cell death，PCD)，通路中涉及miRNA对mRNA的调控。哺乳动物中，miRNA通常与靶mRNA通过6-7个碱基互补结合，抑制靶基因蛋白翻译(即转录后调节)控制细胞生物学过程，使之更有助于深入了解与红细胞储存损伤程中发生的事件，因为红细胞大多数是无细胞核，所以失去了有核细胞的转录调控机制，它们更加需要依赖于存在细胞质中的转录后调节机制生存。
circRNA(circular RNA，circRNA)是一类由成熟的线性RNA反向剪切形成的首尾相连的闭合环形分子，10%以上的人类基因可以转录产生环状RNA，与其转录产生的线性RNA相当，广泛存在于真核细胞内，在无核细胞内也大量存在。最近的研究表明circRNA作为非编码RNA有miRNA海绵功能，能解除miRNA对其靶基因的抑制作用，促进miRNA的靶基因的表达，从而在细胞生理过程发挥重要的作用。circRNA在白血病领域研究较多，在正常红细胞储存过程中的变化及功能还未有研究。
在这个研究背景下，我们对储存于不同时间点的成熟红细胞采用circRNA高通量测序，发现大量未被报道过的circRNA并对已知有差异表达的circRNA从特定的几个通路采用生物信息学及RT-PCR进行筛选，特别对ATP代谢相关circRNA、其靶miRNA及miRNA关联的mRNA做了靶标预测，以了解差异表达的circRNA在红细胞储存中可能发挥的作用及分子机制。
目的
研究红细胞储存过程中circRNA表达谱的变化，预测差异表达的circRNA及其miRNA，探索其在红细胞储存中可能的生物学功能及发挥海绵作用的分子机制。
方法
血液标本为5名25－30岁O型健康合格献血者的标本250mL(人)份，与CPDA-1保存液混合制成悬浮红细胞后，于(4±2)℃专用储血冰箱保存，取其中3份悬浮红细胞于0天、20天、40天时分别提取总RNA储存于-80℃在41天时进行circRNA高通量测序；用RT-PCR技术，验证hsa_circ_0004619、hsa_circ_0000446、hsa_circ_0000619、hsa_circ_0000722、hsa_circ_0000754、hsa_circ_0006717、hsa_circ_0008554、has_circ_0007127、hsa_circ_0007112、Novel_circ_0000311、hsa_circ_0000033、hsa_circ_0049462、hsa_circ_0000739、has_circ_0000847、has_circ_0005546、has_circ_0031038、has_circ_0004724、hsa_circ_0007470、MRP4、hsa-miR-155-5p的表达；对高通量测序数据中的每个circRNA表达量进行统计，并对所有差异表达基因进行注释，满足FDR<0.05(FDR为校准后的P值)，并且|log2FC|>1的条件即为有差异，用火山图、KEGG富集分析、GO分析进一步分析差异基因，筛选出在cAMPsignalingpathway、泛素介导的蛋白水解、凋亡、粘附、MAPKsignalingpathway、半胱氨酸甲硫氨酸代谢、RNA降解、RNA转运、TGF-β、调节肌动蛋白等途径的基因，它们可能对应的miRNA进行靶标预测，对miRNA可能作用的mRNA也进行了关联分析。
结果
1、红细胞内circRNA表达情况:高通量测序分析共发现了2586个已知的和6216个新发现的circRNA，其中有100多种circRNA表达发生变化，第20天与第0天相比，有119种circRNA表达发生改变，升高的有39种，降低的有80种；第40天与第0天相比，有99种circRNA发生改变，表达增高的有47种，降低的有52种；第40天与第20天相比，有110种circRNA发生改变，表达增高的有68种，降低的有42种。在此基础上筛选出18个在红细胞血液中丰度较高，表达模式不同的circRNA，进行RT-PCR验证，并将与has_circ_0007470相关的miRNA、mRNA也进行RT-PCR验证，发现RT-PCR验证结果与芯片结果大体一致。RT-PCR验证结果具体如下：
0天、20天、40天时，hsa_circ_0004619、hsa_circ_0000446、hsa_circ_0000619、hsa_circ_0000722、hsa_circ_0000754、hsa_circ_0006717和hsa_circ_0008554的表达趋势一致，变化倍数分别是：1.00±0.06、0.30±0.12、0.43±0.17，1±0.06、0.38±0.15、0.5±0.23，1±0.06、0.32±0.06、0.44±0.28，1±0.06、0.37±0.17、0.31±0.27，1±0.04、0.30±0.09、0.37±0.19，1.37±0、0.35±0.19、0.47±0.19，1.47±0、0.33±0.19、0.43±0.1。has_circ_0007127,hsa_circ_0007112,Novel_circ_0000311,hsa_circ_0000033,hsa_circ_0049462的表达趋势一致，变化倍数分别是：1.00±0.06、0.35±0.06、1.00±0.46，1.00±0.06、0.384±0.22、0.74±0.19，1±0.06、0.29±0.17、0.68±0.17，1±0.06、0.40±0.18、1±0.30，1±0.06、0.40±0.06、0.90±0.08。hsa_circ_0000739的变化倍数是1±0.06、1.36±0.36、0.41±0.13。has_circ_0000847的变化倍数是1±0.06、4.48±2.43、4.22±2.38。has_circ_0005546的变化倍数是1±0.06、0.34±0.06、0.55±0.16。has_circ_0031038的变化倍数是1±0.06、1.16±0.43、2.0±0.7。has_circ_0004724的变化倍数是1±0.06、0.83±0.25、0.57±0.18。hsa_circ_00007470、MRP4、hsa-miR-155-5p的变化倍数分别是：1.00±0.02、1.36±0.09、0.53±0.16，1.00±0.01、1.87±0.48、0.45±0.20，1.00±0.02、0.43±0.20、0.98±0.29。
2、与circRNA作用的miRNA情况：用mireap、miranda、targetscan和mirTarBase预测到20天比0天时，86个circRNA可靶向作用的miRNA有196个，miRNA可作用的mRNA有246个；40天比0天时，71个circRNA可靶向作用的miRNA有171个，miRNA可作用的mRNA有194个；40天比20天时，69个circRNA可靶向作用的miRNA有160个，miRNA可作用的mRNA有190个。hsa_circ_00007470可靶向作用于hsa-miR-155-5p,hsa-miR-155-5p。
3、通过生物信息学分析、GO分析和KEGG分析显示这些变化的circRNA主要与泛素介导的蛋白水解、RNA降解、RNA转运、cAMP信号通路、红细胞粘着连接、TGF-β信号转导、AMPK信号通路、细胞周期中凋亡通路等生理过程相关。hsa_circ_0007470亲本基因MRP4在cAMP信号通路中发挥重大作用。
4、通过mireap、miranda、targetscan和mirTarBase预测发现hsa_circ_0007470的靶miRNA有hsa-miR-155-5p、hsa-miR-6827-5p，这两个miRNA的靶mRNA是MRP4，与hsa_circ_0007470的来源基因一样。总ATPase及ATP浓度计算结果：在0天、20天、40天时，总ATPase(U/gHb)分别是40.87±5.883、18.300±2.847、10.21±1.636；ATP(U/gHb)分别是8.708±1.25、3.082±0.166、2.462±0.252。
结论
研究表明，储存红细胞中存在100多种表达差异的circRNA，其中下调的circRNA数量较多，且下调幅度比升高幅度更大。在整个红细胞储存期，泛素介导的蛋白水解通路一直为top1，其余通路的名称及排名随储存时间发生变化。说明circRNA的差异表达与红细胞生理状态改变有一定敏感性与相关性。
ATP含量为判断红细胞活力的一个重要指标，据本研究显示20天后储存红细胞的hsa_circ_00007470与ATPase及ATP表达呈同向相关性，且hsa_circ_00007470或许能解除hsa-miR-155-5p对MRP4的抑制作用，通过ATP代谢途径改善红细胞变形能力。
circRNA的靶miRNA及下游靶基因mRNA和蛋白质表达与功能的影响，对进一步了解红细胞储存损伤有积极意义，揭示这些小分子RNA与红细胞能量代谢、形态变化、细胞凋亡等红细胞储存损伤的关系，将为减缓体外低温保存红细胞的代谢、降低其变形性、抑制胞内蛋白降解，提高红细胞输注后携氧能力，改善单位红细胞输注疗效奠定理论基础。
红细胞的生理功能是通过血红蛋白运输氧和二氧化碳，临床上输注红细胞悬液能改善血流动力学，提高携氧量，维持机体的氧化反应。红细胞在体外储存过程中，细胞代谢、功能以及形态学相继发生改变，称之为储存损伤，英文特别用“storagelesion”形容，如：ATP、3-DPG浓度、NO及其衍生物等浓度的持续降低。离体条件下，一般使用CPDA血液保存液储存红细胞并放置于4℃的恒温冰箱中，保质期为35天。保存35天的红细胞输入患者身体后规定至少有70%的红细胞能发挥功能才属于有效输血，近30%红细胞会因为低温下的代谢原因，在体外已发生变形、衰老，很快在脾、骨髓或肝内被裂解溶血。找到与红细胞能量代谢、形态变化等相关的因素，用来抑制红细胞衰老速度，是解决血源紧张、改善单位红细胞的输注疗效的必经之路。
RNA可分为信使RNA(mRNA)、小分子RNA(miRNA)、环状RNA(circRNA)等，初步的研究表明成熟红细胞中也存在凋亡信号通路或程序性死亡通路(programmed cell death，PCD)，通路中涉及miRNA对mRNA的调控。哺乳动物中，miRNA通常与靶mRNA通过6-7个碱基互补结合，抑制靶基因蛋白翻译(即转录后调节)控制细胞生物学过程，使之更有助于深入了解与红细胞储存损伤程中发生的事件，因为红细胞大多数是无细胞核，所以失去了有核细胞的转录调控机制，它们更加需要依赖于存在细胞质中的转录后调节机制生存。
circRNA(circular RNA，circRNA)是一类由成熟的线性RNA反向剪切形成的首尾相连的闭合环形分子，10%以上的人类基因可以转录产生环状RNA，与其转录产生的线性RNA相当，广泛存在于真核细胞内，在无核细胞内也大量存在。最近的研究表明circRNA作为非编码RNA有miRNA海绵功能，能解除miRNA对其靶基因的抑制作用，促进miRNA的靶基因的表达，从而在细胞生理过程发挥重要的作用。circRNA在白血病领域研究较多，在正常红细胞储存过程中的变化及功能还未有研究。
在这个研究背景下，我们对储存于不同时间点的成熟红细胞采用circRNA高通量测序，发现大量未被报道过的circRNA并对已知有差异表达的circRNA从特定的几个通路采用生物信息学及RT-PCR进行筛选，特别对ATP代谢相关circRNA、其靶miRNA及miRNA关联的mRNA做了靶标预测，以了解差异表达的circRNA在红细胞储存中可能发挥的作用及分子机制。
目的
研究红细胞储存过程中circRNA表达谱的变化，预测差异表达的circRNA及其miRNA，探索其在红细胞储存中可能的生物学功能及发挥海绵作用的分子机制。
方法
血液标本为5名25－30岁O型健康合格献血者的标本250mL(人)份，与CPDA-1保存液混合制成悬浮红细胞后，于(4±2)℃专用储血冰箱保存，取其中3份悬浮红细胞于0天、20天、40天时分别提取总RNA储存于-80℃在41天时进行circRNA高通量测序；用RT-PCR技术，验证hsa_circ_0004619、hsa_circ_0000446、hsa_circ_0000619、hsa_circ_0000722、hsa_circ_0000754、hsa_circ_0006717、hsa_circ_0008554、has_circ_0007127、hsa_circ_0007112、Novel_circ_0000311、hsa_circ_0000033、hsa_circ_0049462、hsa_circ_0000739、has_circ_0000847、has_circ_0005546、has_circ_0031038、has_circ_0004724、hsa_circ_0007470、MRP4、hsa-miR-155-5p的表达；对高通量测序数据中的每个circRNA表达量进行统计，并对所有差异表达基因进行注释，满足FDR<0.05(FDR为校准后的P值)，并且|log2FC|>1的条件即为有差异，用火山图、KEGG富集分析、GO分析进一步分析差异基因，筛选出在cAMPsignalingpathway、泛素介导的蛋白水解、凋亡、粘附、MAPKsignalingpathway、半胱氨酸甲硫氨酸代谢、RNA降解、RNA转运、TGF-β、调节肌动蛋白等途径的基因，它们可能对应的miRNA进行靶标预测，对miRNA可能作用的mRNA也进行了关联分析。
结果
1、红细胞内circRNA表达情况:高通量测序分析共发现了2586个已知的和6216个新发现的circRNA，其中有100多种circRNA表达发生变化，第20天与第0天相比，有119种circRNA表达发生改变，升高的有39种，降低的有80种；第40天与第0天相比，有99种circRNA发生改变，表达增高的有47种，降低的有52种；第40天与第20天相比，有110种circRNA发生改变，表达增高的有68种，降低的有42种。在此基础上筛选出18个在红细胞血液中丰度较高，表达模式不同的circRNA，进行RT-PCR验证，并将与has_circ_0007470相关的miRNA、mRNA也进行RT-PCR验证，发现RT-PCR验证结果与芯片结果大体一致。RT-PCR验证结果具体如下：
0天、20天、40天时，hsa_circ_0004619、hsa_circ_0000446、hsa_circ_0000619、hsa_circ_0000722、hsa_circ_0000754、hsa_circ_0006717和hsa_circ_0008554的表达趋势一致，变化倍数分别是：1.00±0.06、0.30±0.12、0.43±0.17，1±0.06、0.38±0.15、0.5±0.23，1±0.06、0.32±0.06、0.44±0.28，1±0.06、0.37±0.17、0.31±0.27，1±0.04、0.30±0.09、0.37±0.19，1.37±0、0.35±0.19、0.47±0.19，1.47±0、0.33±0.19、0.43±0.1。has_circ_0007127,hsa_circ_0007112,Novel_circ_0000311,hsa_circ_0000033,hsa_circ_0049462的表达趋势一致，变化倍数分别是：1.00±0.06、0.35±0.06、1.00±0.46，1.00±0.06、0.384±0.22、0.74±0.19，1±0.06、0.29±0.17、0.68±0.17，1±0.06、0.40±0.18、1±0.30，1±0.06、0.40±0.06、0.90±0.08。hsa_circ_0000739的变化倍数是1±0.06、1.36±0.36、0.41±0.13。has_circ_0000847的变化倍数是1±0.06、4.48±2.43、4.22±2.38。has_circ_0005546的变化倍数是1±0.06、0.34±0.06、0.55±0.16。has_circ_0031038的变化倍数是1±0.06、1.16±0.43、2.0±0.7。has_circ_0004724的变化倍数是1±0.06、0.83±0.25、0.57±0.18。hsa_circ_00007470、MRP4、hsa-miR-155-5p的变化倍数分别是：1.00±0.02、1.36±0.09、0.53±0.16，1.00±0.01、1.87±0.48、0.45±0.20，1.00±0.02、0.43±0.20、0.98±0.29。
2、与circRNA作用的miRNA情况：用mireap、miranda、targetscan和mirTarBase预测到20天比0天时，86个circRNA可靶向作用的miRNA有196个，miRNA可作用的mRNA有246个；40天比0天时，71个circRNA可靶向作用的miRNA有171个，miRNA可作用的mRNA有194个；40天比20天时，69个circRNA可靶向作用的miRNA有160个，miRNA可作用的mRNA有190个。hsa_circ_00007470可靶向作用于hsa-miR-155-5p,hsa-miR-155-5p。
3、通过生物信息学分析、GO分析和KEGG分析显示这些变化的circRNA主要与泛素介导的蛋白水解、RNA降解、RNA转运、cAMP信号通路、红细胞粘着连接、TGF-β信号转导、AMPK信号通路、细胞周期中凋亡通路等生理过程相关。hsa_circ_0007470亲本基因MRP4在cAMP信号通路中发挥重大作用。
4、通过mireap、miranda、targetscan和mirTarBase预测发现hsa_circ_0007470的靶miRNA有hsa-miR-155-5p、hsa-miR-6827-5p，这两个miRNA的靶mRNA是MRP4，与hsa_circ_0007470的来源基因一样。总ATPase及ATP浓度计算结果：在0天、20天、40天时，总ATPase(U/gHb)分别是40.87±5.883、18.300±2.847、10.21±1.636；ATP(U/gHb)分别是8.708±1.25、3.082±0.166、2.462±0.252。
结论
研究表明，储存红细胞中存在100多种表达差异的circRNA，其中下调的circRNA数量较多，且下调幅度比升高幅度更大。在整个红细胞储存期，泛素介导的蛋白水解通路一直为top1，其余通路的名称及排名随储存时间发生变化。说明circRNA的差异表达与红细胞生理状态改变有一定敏感性与相关性。
ATP含量为判断红细胞活力的一个重要指标，据本研究显示20天后储存红细胞的hsa_circ_00007470与ATPase及ATP表达呈同向相关性，且hsa_circ_00007470或许能解除hsa-miR-155-5p对MRP4的抑制作用，通过ATP代谢途径改善红细胞变形能力。
circRNA的靶miRNA及下游靶基因mRNA和蛋白质表达与功能的影响，对进一步了解红细胞储存损伤有积极意义，揭示这些小分子RNA与红细胞能量代谢、形态变化、细胞凋亡等红细胞储存损伤的关系，将为减缓体外低温保存红细胞的代谢、降低其变形性、抑制胞内蛋白降解，提高红细胞输注后携氧能力，改善单位红细胞输注疗效奠定理论基础。