猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种急性、接触性传染病，可引起各日龄猪的呕吐、腹泻、脱水，并造成哺乳仔猪死亡率增高。PEDV基因组具有持续突变和发生重组的特性，近年来各种PEDV变异毒株频繁出现且广泛流行，给全球养猪业带来巨大损失。持续开展PEDV的遗传进化调查，可以明确PEDV的流行特征和演化规律以指导临床防控。华中地区是我国重要的生猪养殖和调运基地。本研究以华中部分地区养猪场仔猪腹泻病例为研究对象，通过开展病原检测、序列测定与分析、病毒分离与鉴定等研究，为揭示PEDV流行病学规律和分子演化特征奠定基础。
　　目前多数研究以非洲猴肾细胞(Vero)和猪小肠上皮细胞(IPEC)等传代细胞系为模型探索PEDV的感染、免疫与致病机制，难以反映PEDV在动物体内实际感染状况。因此，本研究以2日龄仔猪为感染模型，系统性测定PEDV临床分离株在感染仔猪不同组织的分布，并利用转录组学揭示PEDV感染后仔猪空肠和脾脏组织宿主应答变化。最后，本研究初步探索PEDV对猪原代肺泡巨噬细胞(porcine pulmonary alveolar macrophage，PAM)的易感性，并研究网格蛋白(clathrin)和唾液酸粘附素(sialoadhesin，Sn)介导的内吞途径在PEDV入侵PAM中的作用。本研究可为PED临床防控与致病机制研究奠定基础。
　　1、华中部分地区猪流行性腹泻病毒的遗传变异分析
　　本研究对2015年至2016年间华中部分地区仔猪疑似腹泻样品进行病原学检测，证明PEDV是引起仔猪发生腹泻的主要病原。对PEDV检测阳性样品进行序列测定，成功获得14株PEDVS基因全长序列，序列分析证实该地区PEDV流行毒株主要属于G2a和G2b基因型。发现了PEDVS基因存在特殊插入特征的变异毒株，其中4株PEDVS2基因存在3nt缺失;1株PEDV(HNAY毒株)S1基因存在独特的21个碱基插入，该插入序列来源于N基因，位于S1A蛋白活动结构域。对PEDV毒株全基因组重组分析发现HNAY毒株存在重组现象，其亲本毒株分别是我国早期PEDV流行毒株HNZZ47与GDS28。本研究首次发现S1基因存在21个碱基插入的新的PEDV毒株，为PEDV临床诊断、预警与防控提供参考。
　　2、PEDV流行毒株的分离及动物感染研究
　　为评估不同PEDV临床毒株致病性差异，将PEDV检测阳性样品接种Veto细胞，成功分离到3株PEDV毒株。细胞感染实验发现3株病毒均能在Vero细胞有效复制，并出现明显的膜融合和多核合胞体现象。动物感染实验显示3株PEDV毒株感染2(口)龄仔猪均在攻毒后12-24h出现腹泻和呕吐等PEDV典型症状和病理变化，其中S1基因存在21个碱基插入的HNAY毒株感染仔猪在更短时间内死亡。此外，免疫组化分析显示HNAY毒株对仔猪肠道组织有着更广泛的感染嗜性。本研究成功分离到3株PEDV临床毒株，并比较了不同毒株体内外感染特性，发现HNAY毒株对仔猪具有更严重的致病性。
　　3、PEDV感染仔猪病毒分布及感染组织的转录组学分析
　　为探究PEDV对肠道以外其他器官、组织或细胞的感染特性，以PEDVHB分离株为代表感染2日龄仔猪，并系统性测定PEDV感染后病毒在体内的动态分布，证明PEDV流行毒株不但能感染肠组织，而且在肺、脾、外周血等组织器官也能有效感染，证明PEDV具有引起多器官和多细胞感染的泛嗜性特点。进一步对PEDV感染的仔猪空肠和脾脏进行了转录组测序与分析，发现PEDV感染空肠后导致541个基因上调和540个基因下调;GO分析、KEGG分析发现天然免疫应答和炎症应答在PEDV感染肠道中的潜在作用;同样，PEDV感染脾脏导致392个基因表达变化，其中162个上调，230个下调;进一步利用GO分析和KEGG分析，发现免疫系统和防御反应相关基因在PEDV感染脾脏中的潜在作用。该研究为深入探索PEDV引起仔猪多器官感染和宿主防御机制奠定基础。
　　4、PEDV对PAN感染特性和入侵机制
　　为明确PEDV对巨噬绌胞的感染嗜性，我们首先利用免疫组化技术检测病毒在肺组织的分布情况;并分离原代猪PAM，系统性测定PEDV对PAM的感染性，发现PEDV可以感染PAM但不能有效复制，也不能引起明显细胞病变;PEDV感染的PAM胞内和胞外病毒均具有持续的感染性。为进一步探索PEDV入侵PAM的途径，利用蛋白共定位、基因敲减以及特异性抑制等实验，确定PEDV通过网格蛋白介导的内吞途径进入PAM;细胞表面Sn也参与了PEDV入侵PAM的过程。本研究丰富了PEDV感染的组织嗜性研究，并为揭示PEDV感染和入侵PAM的分子机制奠定基础。