家蚕（Bombyx mori）属于鳞翅目蚕蛾科,是一种重要的经济昆虫,以家蚕为主体的丝绸业一直是我国的优势传统产业,蚕桑业在我国农村经济中长期占有重要地位。此外,家蚕具有发育周期短、个体大小适中、易饲养、繁殖能力较强等特点,是研究鳞翅目昆虫的良好模式生物,具备悠久的研究历史,积累了大量研究经验,并存留有多种珍贵的突变体和育种品系。变态发育是一个极为复杂的发育过程,涉及到保幼激素（Juvenile Hormone,JH）和蜕皮激素（Ecdysone,Ecd）参与的多级调控网络,有数量众多的基因在此过程中发挥作用。其中,蜕皮激素的成体20-羟基蜕皮酮（20-Hydroxyecdysone,20E）主导的调控网络研究比较深入,经典研究揭示:20E进入细胞以后首先与其核受体Ec R结合,随后与无脊椎动物受体USP结合形成异源二聚转录复合物,由Ec R-USP复合物启动下游E93、E75B、Br-C等初级响应基因,初级响应基因进一步激活次级响应基因和各种效应基因,从而促进昆虫变态发育的进程。近年来,有学者发现20E也具有膜受体和膜信号通路,并发现了跨膜转运蛋白和潜在的膜受体蛋白,但具体机制还有待进一步研究。这些新的发现提示我们,20E信号转导通路可能比当前理论认为的更加复杂,还亟需新的技术更加全面地揭示参与20E信号通路的基因及其详细作用机制。传统的20E研究主要从突变表型、单个基因出发,通过相互作用或功能关联逐步解析其信号通路,不仅耗时耗力,而且难以全面地揭示整个信号通路。随着基因组、转录组、蛋白质组、代谢组等生物多组学技术的进步,越来越多的研究从基因组层面上进行探索,综合理解变态发育。在哺乳动物细胞和少数经典模式生物中,将CRISPR基因编辑技术和高通量组学结合形成的全基因组编辑筛选成为了当今功能基因组研究的趋势。全基因组编辑文库筛选技术能够打破传统定位克隆技术及参考近缘物种研究方法的局限性,不依赖已有的基因功能信息和精细实验设计,并能在全基因组范围展开基因功能研究。本实验室在长期开展昆虫基因组编辑研究的基础上,建立了基于家蚕BmE细胞的全基因组编辑文库,并通过必需基因鉴定、BmNPV抗性、环境污染物耐受性等多种筛选证明了该文库在规模化功能基因组研究中的高效性。因此,本论文针对家蚕20E信号通路还没有完全解析清楚的问题,在前期系统开展基因组编辑研究、建立全基因组CRISPR文库筛选平台的基础上,提出通过全基因组CRISPR文库筛选家蚕20E通路的相关基因。我们综合运用流式细胞术、CRISPR全基因组编辑细胞文库筛选、突变体鉴定等多种技术,联合遗传学、分子生物学、生物信息学等多种学科相关的试验方法,解析家蚕20E作用通路的关键基因及其作用机制。取得的主要结果如下:1.针对20E全基因组筛选的条件摸索为了进行有效的全基因组CRISPR文库筛选,需要探究20E添加对家蚕BmE细胞的生理学效应,并确定相应的筛选条件。据已有文献报道,目前普遍认为促进细胞凋亡是20E发挥作用的主要方式。对此,我们在家蚕胚胎细胞系（Bombyx mori Embryonic,BmE）的层面进行了20E诱导细胞凋亡的验证。通过添加不同浓度的20E处理BmE细胞,使用碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）对细胞进行染色,之后用流式细胞仪检测细胞凋亡。结果显示:有些处理组随着20E浓度的提高以及处理时间的延长,细胞的凋亡情况呈现逐渐增加的趋势,但是整体规律并不明显,且存在一些误差较大的节点。说明20E处理确实可以引起BmE细胞的凋亡,但凋亡信号不是特别强,因此不适合用检测凋亡的方式制定筛选策略。由于不能直接使用凋亡情况反映BmE细胞在20E处理后的状态变化,于是我们使用细胞活力检测方法（MTS）测定细胞活性来反映20E处理后BmE细胞的活性变化。使用不同浓度的20E处理BmE细胞,一周后收集细胞,使用MTS法测定细胞活性。试验结果显示:当使用浓度为80μM时,20E处理组和DMSO对照组的细胞活性会有显著差异。而继续增大浓度后,DMSO也会产生细胞毒性作用,因此我们将80μM作为细胞库的筛选浓度。2.20E作用通路相关基因的文库筛选本实验室前期在家蚕中构建了基于CRISPR/Cas9的全基因组编辑细胞文库,并成功完成了对家蚕响应（非）生物胁迫因素相关基因的筛选,证明了CRISPR文库筛选在家蚕中的可行性。于是我们开展了基于该细胞文库的筛选工作。使用80μM浓度的20E处理BmE细胞全基因组编辑文库,在处理组的细胞融合度达到5%-10%时收集细胞,PCR扩增sgRNA,将产物进行高通量测序,经数据过滤、拼接、比对后获得筛选结果:我们一共鉴定到887个显著富集基因和876个显著消耗基因。其中有我们已知的20E通路下游的关键基因E93,该基因在我们的筛选体系中排第三,这在一定程度上证明了筛选结果的可靠性。而在果蝇中鉴定到的蜕皮激素跨膜转运蛋白编码基因ECI在家蚕中同源性相对最高的基因BGIBMGA002723并没有受到显著富集,这提示20E的跨膜转运机制在家蚕和果蝇之间存在差异。而也有一些已报道和20E相关,但在筛选中排名靠后甚至未显著富集的基因,如BR-C、Ftz-f1等,我们推测可能是其在个体水平和细胞水平的表达差异以及某些gRNA的效率过低所致。我们对文库筛选结果和20E处理BmE细胞的转录组数据进行联合分析发现,显著富集且上调表达的基因占比最多,表示参与20E通路的基因多数受其诱导上调表达。通过对部分排名靠前的基因进行q RT-PCR验证,进一步证明它们确实与20E信号通路相关。后面我们对筛选结果进行了GO分类,根据生物学过程、细胞组分和分子功能将其分为三大类。在这其中占比最高的两项是分子功能中的“结合”和“催化”,我们推测20E主要通过影响家蚕某些特定蛋白质的功能来发挥调控作用。我们根据基因的富集与消耗对其功能做了进一步分类,发现在已注释的基因中,酶类的占比最高,这进一步说明了20E会影响家蚕某些关键酶的功能。在亚细胞定位的结果中,富集和消耗的基因都主要表达在细胞质和细胞核,而细胞膜上较少。这表示家蚕20E的信号转导主要在细胞质和细胞核中完成,而没有太多基因参与家蚕20E跨膜转运。在细胞质中,富集基因的分布占主导,而在细胞核中则是消耗基因为主。这表示家蚕20E通路的激活过程主要在细胞质内完成,而通路的抑制过程则主要发生在细胞核内。通过对筛选结果进行KEGG通路富集分析,我们找到了显著富集的通路:肌醇磷酸化代谢,Toll和Imd,Gly、Ser、Thr代谢及Hippo信号通路以及显著消耗的通路mTOR,Cys和Met代谢,自噬及Toll和Imd信号通路。通过对结果的分析,我们确定了与家蚕20E信号转导相关的基因和通路,可开展后续的验证工作。3.核心候选基因的验证家蚕的先天免疫信号通路Toll和Imd在富集和消耗的基因中排名均较靠前,表示20E可能影响家蚕的先天免疫。其中消耗基因主要分布在Toll通路,而富集基因则分布在Imd通路,由此我们推测,Imd通路可能参与家蚕20E的信号转导,而Toll通路则对其有抑制作用。肌醇磷酸化代谢在富集通路中排名第一,其中包含top23的富集基因norp A,其注释为磷酸酶C的β4亚基。敲除norp A会提高BmE细胞对20E的耐受性,表示其确实参与了家蚕20E信号转导的过程。我们通过Western blotting检测了磷酸化通路中的关键分子PI3K,结果显示PI3K的磷酸化程度会随着20E处理时间的延长而增加,表示20E可以引起磷酸化信号通路的激活。mTOR和自噬分别是消耗通路中排名第一和第三的通路。mTOR信号通路在维持营养代谢平衡上有重要作用,其消耗表示20E可能会干扰家蚕细胞内的营养和能量代谢平衡。使用mTOR通路的抑制剂雷帕霉素处理细胞后,BmE细胞对20E的响应更加敏感,进一步说明细胞需要在营养物质代谢平衡的条件下才能抵抗20E的作用。自噬是细胞在自身营养物质匮乏时,通过降解自身非必须细胞组分来维持生存的调节机制。敲除自噬通路的基因GH19770会加快20E致死细胞的过程,表示在20E处理的筛选压力下,若细胞的自噬通路受损,则会难以维持生存,从而发生细胞凋亡。总的来说,我们利用家蚕全基因组编辑细胞库筛选得到20E通路中的相关基因,其中有887个富集基因和876个消耗基因。分类注释结果表明20E会影响家蚕某些关键蛋白质的功能来发挥调控作用,这些过程主要在细胞质和核内完成。通路富集分析显示20E能激活家蚕细胞的磷酸化信号通路,且有可能影响其先天免疫,并干扰细胞内的营养与能量代谢,最终引起细胞凋亡。在敲除相关基因后,细胞对20E的耐受性会提高。本论文从家蚕20E信号通路的未知部分入手,以家蚕为模式,利用CRISPR/Cas9全基因组编辑和文库筛选等前沿技术手段,揭示了参与20E信号通路的关键基因及其分子机制,将可能为昆虫发育变态研究提供重要的新见解,也能为昆虫群体的人为调节提供理论依据,具有重要的理论和实际应用价值。